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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-83899
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/8389/


Kasparyan, Elena

Intermolekulare asymmetrische Stetter Reaktion mit Thiamin Diphosphat (ThDP)-abhängigen Enzymen

Intermolecular asymmetric Stetter reaction with Thiamine Diphosphate (ThDP)-Dependent Enzymes

Dokument1.pdf (8.030 KB) (md5sum: b7509bf5a7fa4cb1b5e53ebe7ce45028)

Kurzfassung in Deutsch

Asymmetrische Bindungsknüpfungsreaktionen spielen eine grundlegende Rolle bei der Naturstoffsynthese. Viele ThDP-abhängige Enzyme besitzen 1,2-Carboligationsaktivität. Weitere Entdeckungen, wie enzymatische enantioselektive intermolekulare 1,4-Additionen (Stetter-Reaktion), bieten neue Perspektive in diesem Gebiet.
Als Ausgangspunkt für die hier beschriebenen Studien diente die erste asymmetrische, enzymkatalysierte Stetter-Reaktion, katalysiert durch die ThDP-abhängige Stetterase SmPigD aus Serratia marcescens. Diese Biotransformation stellt die 1,4-Carboligationsreaktion zwischen 2,3-ungesättigten Verbindungen als Akzeptorsubstraten (Michael-Akzeptoren) und 2-Ketosäuren als Donorsubstraten dar. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der weiteren Entwicklung der enzymkatalysierten Stetter-Reaktion. Anhand drei weiterer ThDP-abhängiger Enzyme (SeAAS aus Saccharopolyspora erythraea, HapD aus Hahella chejuensis und PlAAS aus Photorhabdus luminescens subsp. laumondii) wurde gezeigt, dass es sich im Fall von SmPigD nicht um ein einzelnes Beispiel handelte. Mit dieser Erkenntnis wurde ein Beitrag zur Enzymklasse der Stetterasen geleistet.
Das Substratspektrum der Enzyme SmPigD, SeAAS und HapD wurde bezüglich des Michael-Akzeptors verglichen. Es stellte sich heraus, dass jedes dieser Enzyme ein charakteristisches Akzeptorsubstratspektrum besitzt. Alle diese Enzyme sind hochenantioselektiv, ausgenommen gegenüber 2,3-ungesättigten Akzeptorsubstraten. Es wurde nachgewiesen, dass alle drei Enzyme gleiche Produkt-Konfiguration generieren, was dank vorgegangenen Arbeiten anhand des aromatischen Stetter-Produktes zu (R)-Konfiguration zugeordnet werden konnte.
Weiter wurde der Frage nach der natürlichen Funktion und dem physiologischen Substrat der Enzyme nachgegangen. Ausgangspunkt war das am besten umgesetzte Akzeptorsubstrat für SmPigD (in Vorarbeiten) sowie für HapD (in dieser Arbeit) (E)-S-2-Acetamidoethyloct-2-enthioat (SNAC-Ester). Es wurde postuliert, dass das physiologische Substrat durch eine Fettsäuresynthase synthetisiert wird und während der untersuchten 1,4-Additionsreaktion an Acyl Carrier Protein gebunden bleibt. Somit werden die weiteren Arbeiten hinsichtlich der enantioselektiven Stetter Biotransformation in vivo von Interesse.
Ferner wurde 1,2-Carboligationsaktivität von SeAAS und HapD gezeigt. Die Reaktion zwischen Benzaldehyd und Pyruvat lieferte chirale 1,2-Carboligationsprodukte (2-Hydroxyketone).


Kurzfassung in Englisch

Enantioselective enzymatic C-C coupling reactions are of great interest for biocatalytic synthesis strategies. Many thiamine diphosphate (ThDP)-dependent enzymes have already shown 1,2-carboligation activity resulting in the chiral 2-hydroxyketones as reaction products. Innovations like the enzymatic enantioselective intermolecular 1,4-carboligation reaction (Stetter reaction) under formation of bifunctional compounds, 1,4-diketones, opens a new perspective in this field.
As reported earlier, the ThDP-dependent enzyme SmPigD from Serratia marcescens catalyzes the enantioselective intermolecular Stetter reaction between 2,3-unsaturated ketones as acceptor (Michael-acceptors) and 2-ketoacids as donor substrate. This work is focused on the investigation of this unique enzymatic activity. Three non-characterised ThDP-dependent enzymes from different species (SeAAS from Saccharopolyspora erythraea, HapD from Hahella chejuensis und PlAAS from Photorhabdus luminescens subsp. laumondii) were produced recombinantly in E. coli and catalyzed the intermolecular Stetter reaction. Hence we report about the new enzyme class “stetterases”.
Further studies revealed that each of the enzymes, SmPigD, SeAAS and HapD, possesses a characteristic substrate spectrum concerning the Michael-acceptor. Both, aliphatic and aromatic 2,3-unsaturated ketones were analyzed as Michael-acceptors. All enzymes were highly enantioselective. However, the absolute configuration of the products is the same in all cases. By comparison with published data of the aromatic Stetter product it was assigned as (R).
The enzyme HapD showed a very high affinity towards the best substrate described for SmPigD, the aliphatic 2,3-unsaturated thioester (E)-S-2-acetamidoethyloct-2-enthioate (SNAC-thioester). We postulate that under physiological conditions the acceptor is synthesised by a fatty acid synthase and is still bound to an acyl carrier protein during the 1,4-carboligation reaction. This finding might be useful for further development of the enantioselective Stetter biotransformation in vivo.
Additionally, this work demonstrates that SeAAS and HapD are also able to catalyze C-C bond forming reactions between aldehydes and the 2-ketoacid pyruvate yielding chiral 2-hydroxy ketones (1,2-carboligation reaction).


SWD-Schlagwörter: Biokatalyse , Thiamindiphosphat
Freie Schlagwörter (deutsch): 1,4-Carboligation , C-C Kupplung , Chemoenzymatische Synthese , Umpolung
Freie Schlagwörter (englisch): 1,4-carboligation , C-C coupling , chemoenzymatic synthesis , Umpolung
Institut: Institut für Pharmazeutische Wissenschaften
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Müller, Michael (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 30.11.2011
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 13.12.2011
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