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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-84067
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/8406/


Du, Juan

Structural investigation and mechanism of the bifunctional fructose-1,6-bisphosphate aldolase/phosphatase

Strukturinvestigation und Reactionsmechanismus der bifunktionellen Fructose-1,6-bisphosphat Aldolase/Phosphatase

Dokument1.pdf (90.364 KB) (md5sum: 658c887e80ecee4364848d752f898116)

Kurzfassung in Englisch

Fructose-1,6-bisphosphate (FBP) aldolase/phosphatase is a bifunctional, thermostable enzyme that catalyses two subsequent steps in gluconeogenesis. It is found in most archaeal groups and deeply branching bacterial lineages that harbor thermophilic organisms [1, 2, 3]. As an essential gluconeogenic enzyme, it converts heat–labile dihydroxyacetone phosphate (DHAP) and glyceraldehyde–3–phosphate (GAP) by al- dol condensation to FBP [4], and subsequently catalyzes the irreversible hydrolysis of FBP to stable Fructose 6–phosphate (F6P) and inorganic phosphate (Pi).
In order to understand the mechanism of bifunctionality, several three–dimentional structures of FBP aldolase/phosphatase from Thermoproteus neutrophilus and Ce- narchaeum symbiosum were solved in a ligand–free state as well as in complex with the substrates DHAP, FBP, the product F6P, and also several important mutants, to resolution up to 1.3 Å. Based on these high resolution structures, several large conformational changes of highly flexible loops during the reactions were observed. As expected, these loops act as a switch between aldolase and phosphatase activities. While most multifunctional enzymes catalyze the different reactions at different active sites, this bifunctional FBPAP represents suprisingly different catalytic functionalities at the same location, with a substantial remodeling of the active site.
Supported by mutagenesis data and thermodynamic characterization, the struc- tures pinpoint exactly which residues are responsible for the two reaction steps and show that the sequential binding of additional Mg2+ ions is essential for guiding the reaction. With these findings, a complete reaction mechanism is proposed. This doc- toral thesis revolves around how consecutive structural rearrangements reorganize the catalytic center of the protein in order to carry out two canonical reactions in a very non–canonical type of bifunctionality.


Kurzfassung in Deutsch

Die Fructose-1,6-bisphosphat (FBP) Aldolase/Phosphatase (FBPase) ist ein bifunktionelles, thermostabiles Enzym, welches zwei aufeinander folgende Schritte der Gluconeogenese katalysiert. Es kommt in den meisten Gruppen der Archäen ebenso vor wie in jenen tief verzweigten bakteriellen Abstammungslinien, welche thermophile Organismen beinhalten. Als essentielles gluconeogenes Enzym wandelt die FBPase hitze-labiles Dihydroxyacetonphosphat (DHAP) und Glycerinaldehyd-3-Phosphat (GAP) in einer Aldolkondensation zu FBP um und katalysiert anschließend die irreversible Hydrolyse von FBP zu stabilem Fructose-6-Phosphat (F6P) und anorganischem Phosphat (Pi).
Um den Mechanismus der Bifunktionalität zu verstehen, wurden mehrere drei-dimensionale Strukturen der FBPase aus Thermoproteus neutrophilus und Cenarchaeum symbiosum sowie einige wichtige Mutanten des Enzyms mit einer Auflösung von bis zu 1,3 Å gelöst, und zwar sowohl in ligandenfreiem Zustand als auch komplexiert mit den Substraten DHAP, FBP und dem Produkt F6P. Auf der Basis dieser hochauflösenden Strukturen konnten einige große Konformationsänderungen hoch flexibler Schleifen während der Reaktionen beobachtet werden. Gemäß den anfänglichen Erwartungen fungieren diese Schleifen als Schalter zwischen Aldolase- und Phosphataseaktivität. Während die meisten multifunktionellen Enzyme verschiedene Reaktionen an verschiedenen Aktivzentren katalysieren, umfasst hingegen die bifunktionelle FBPase erstaunlicherweise unterschiedliche katalytische Funktionalitäten am selben Ort, einhergehend mit einer substantiellen Umformung des Aktivzentrums.
Die Strukturen zeigen deutlich auf, welche Aminosäureseitenketten für die zwei Reaktionsschritte verantwortlich zeichnen und sie demonstrieren, daß die sequentielle Bindung von Mg2+-Ionen wesentlich für die Richtungsvorgabe der Reaktion ist. Diese Befunde werden zusätzlich durch Mutagenesedaten und eine thermodynamische Charakterisierung gestützt. Anhand dieser Erkenntnisse wird ein vollständiger Reaktionsmechanismus vorgeschlagen. Diese Dissertation beschäftigt sich also schließlich mit der Fragestellung, wie aufeinander folgende strukturelle Änderungen das Katalysezentrum der FBPase reorganisieren müssen, damit es zwei Lehrbuchreaktionen in einer sehr ungewöhnlichen Art der Bifunktionalität durchführen kann.


SWD-Schlagwörter: Proteinkrystallographie
Freie Schlagwörter (englisch): protein crystallography , biochemistry
Institut: Institut für Organische Chemie und Biochemie
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Einsle, Oliver (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 31.10.2011
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 22.12.2011
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