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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-84261
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/8426/


Zoellner, Anna-Katharina

Charakterisierungsstudien der T-Zellen von Rap1a defizienten Mäusen

Characterisation studies of Rap1a deficient mice

Dokument1.pdf (2.239 KB) (md5sum: 8b18c88ceba8438f1d261ea6ac421ef3)

Kurzfassung in Deutsch

Rap1a ist ein G-Protein aus der Familie der RAS G-Proteine. Rap1 liegt in zwei Isoformen vor, Rap1a und Rap1b. Wie für G-Proteine typisch, unterscheidet man die GTP gebundene, aktive und GDP gebundene, inaktive Form. Die Aktivität der GTPase Rap1a wird durch verschiedene GEFs, “guanine nucleotid exchange faktors” und GAPs “GTPase activating Proteins” reguliert (Quilliam, Rebhun et al. 2002; Wittinghofer and Pai 1991).
Die Bedeutung von Rap1a wurde bisher in verschieden Bereichen erkannt:
In T-Zellproliferationsstudien wird aktives Rap1a als ein Antagonist des Ras-ERK Signalweges diskutiert (Schmitt and Stork 2001), sowie eine Beteiligung von Rap1a in der regulären alpha/beta-T-Zell Entwicklung beschrieben (Kometani, Moriyama et al. 2008).
In der Integrinregulation und Zelladhäsion ist Rap1a als ein bedeutender adhäsionsfördender Regulator identifiziert worden (Kometani et al. 2004) und zunehmend wird eine Rolle von Rap1a in bestimmten Malignitäten angenommen (Itoh, Nelson et al. 2007).
Ziel dieser Arbeit war es anhand eines in unserer Arbeitsgruppe generierten Rap1a Knockout Maus (Duchniewicz, Zemojtel et al. 2006) eine Analyse von Rap1a defizienten CD3 respektive CD4 positiven T-Zellen durchzuführen.
Dabei wurden mit verschiedenen Methoden die Zytokine der Th1 Antwort (TNF alpha, IFN gamma, IL-2), die T-Zellproliferation sowie die MAP Kinasen ERK und p38 nach Stimulation durch PMA/Ionomycin und CD3/CD28 untersucht.
Zuerst wurden intrazelluläre Zytokinfärbungen mit Auswertung am Olympus SCAN^R etabliert und vergleichend eine FACS Auswertung vorgenommen. Zudem wurden Zytokine mit der ELISA-Technik gemessen und die Phosphorylierung der MAP Kinasen im Western Blot untersucht. Die T-Zellproliferation wurde im BrdU bestimmt.
Es zeigte sich eine vermehrte TNF alpha und IFN gamma Expression nach CD3/CD28 Stimulation sowie eine vermehrte Phosphorylierung der MAP Kinasen bei T-Zellen aus Rap1a defizienten Mäusen im Vergleich zu Zellen aus Wildtypmäusen. Bei der IL-2 Expression sowie der T-Zellproliferation war kein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Zellgruppen messbar.
Diese Ergebnisse deuten auf eine unspezifisch verstärkte TH1 Antwort in Rap1a defizienten T-Zellen hin. Dies, und die vermehrte Phosphorylierung von ERK und p38 in Rap1a defizienten T-Zellen, lässt sich im Zusammenhang mit der schon 2001 von Schmitt und Stork diskutierten Antagonisierung des Ras-ERK Weges durch Rap1a sehen.


Kurzfassung in Englisch

Rap1a is a G-protein from the sub-family of Ras G-proteins. Rap1 exists in two isoforms, Rap1a and Rap1b. G-proteins change between a GTP-bound active, and GDP-bound inactive form. The activity of the GTPases is regulated by GEFs "guanine nucleotide exchange factors" and GAPs "GTPase activating protein" (Quilliam, Rebhun et al 2002;. Wittinghofer and Pai 1991). Rap1a has many different functions in intracellular signal transduction: In T-cell proliferation, it is assumed that active Rap1a acts as an antagonist of the Ras-ERK signaling pathway (Schmitt and Stork 2001). Furthermore, Rap1a is important for alpha/beta-T cell development (Kometani, Moriyama et al. 2008) and plays a major role at regulation of integrins and cell adhesion (Kometani et al. 2004). Recent data even suggests Rap1a’s involvement in tumorgenesis (Itoh, Nelson et al. 2007).
The aim of this study was to further analyze the Rap1a knockout mouse, which was generated in our group (Duchniewicz, Zemojtel et al. 2006) and to continue to characterize Rap1a deficient T-cell subpopulations.
With various methods, the Th1 cytokines response (TNF alpha, IFN gamma, IL-2) was examined and T-cell proliferation as well as signaling pathways including the MAP kinases p44/42 and p38 after stimulation with PMA / ionomycin or CD3/CD28 were analyzed. First, intracellular cytokine staining was performed and analysis on Olympus SCAN ® was established and compared to FACS analysis. In addition, cytokines were measured using the ELISA technique. Western blots were performed to measure phosphorylation of kinases. T-cell proliferation was determined by BrdU assay.
Taken together, the analyses showed an increased TNF-α expression and increased phosphorylation of p44/42 and p38 kinases after PMA / ionomycin stimulation, and increased cell proliferation in T- cells from Rap1a deficient mice compared to wild type T- cells. These results indicate a nonspecific increased TH1 response in Rap1a-deficient T- cells. In combination with the increased phosphorylation of p44/42 and p38 in Rap1a deficient T- cells, the results can be interpreted that Rap1a antagonizes the Ras-p44/42 pathway.


SWD-Schlagwörter: T-Zellen
Freie Schlagwörter (deutsch): Rap1a
Freie Schlagwörter (englisch): Rap1a
Institut: Medizinische Univ.-Klinik und Poliklinik
Fakultät: Medizinische Fakultät / Universitätsklinikum
DDC-Sachgruppe: Medizin und Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Scheele, Jürgen (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 19.07.2010
Erstellungsjahr: 2012
Publikationsdatum: 17.01.2012
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