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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-84321
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/8432/


Labatzke, Ramona

Crystal structure determination of a subfragment of the NADH:ubiquinone oxidoreductase from Aquifex aeolicus and functional reconstitution of a nitrate - nitrite transporter from Escherichia coli

Kristallstruktur eines Subfragmentes der NADH:Ubichinon Oxidoreduktase aus Aquifex aeolicus und die funktionelle Rekonstitution eines Nitrat- Nitrit Transporters aus Escherichia coli

Dokument1.pdf (20.380 KB) (md5sum: aedef216a65d4348ece671760b1ded29)

Kurzfassung in Englisch

Nitrogen is essential for the synthesis of nucleic acids, amino acids and proteins which are important biopolymers. The biochemistry of nitrogen is almost entirely dependent on reduction-oxidation (redox) reactions mediated by microorganisms. The nitrogen cycle consists of several metabolic pathways where each pathway is describing a part of the redox process. Escherichia coli is able to use nitrate or ammonia as nitrogen source. Therefore, nitrate is either reduced to ammonia in the periplasm and subsequently, transported to the cytoplasm or primarily, nitrate is transported across the membrane and then reduced to ammonia. E. coli possesses three nitrate reductases and two nitrite reductases that reduce nitrate to nitrite and then to ammonium. Furthermore, four transporter proteins are present in E. coli: one for ammonium and three for nitrate and nitrite (NarK, NarU and NirC). Regarding the transport classification system of M. Saier (2000), NarK is a member of the major facilitator superfamily (MFS), categorised as secondary transporter requiring the generation of a proton motive force. Within this group, NarK as well as its homologue NarU belong to the nitrate/ nitrite transporter (NNT) family. The mechanism of the nitrate/ nitrite transporter NarK is not well understood due to the lack of a high resolution crystal structure. In vivo studies revealed a nitrate/ nitrite antiport and additionally suggested a nitrate/ proton symport. In order to examine the kinetics, NarK was functionally reconstituted in liposomes and a transport assay was established. The quenching reaction of a fluorescent dye that was trapped inside the (proteo)liposomes was used to detect the nitrate/ proton symport. So far, a steady value of the reaction rate constant could not be established, neither in liposomes nor proteoliposomes. This problem is probably caused by aggregation of liposomes and could not be solved within this thesis.

The second part of this thesis is concerned with the membrane bound NADH:ubiquinone oxidoreductase, the respiratory complex I, which is the first enzyme complex in the respiratory chains of mitochondria and several bacteria. This enzyme catalyses the transport of two electrons from NADH to ubiquinone and the translocation of four protons from the negative inside to the positive outside of the cytoplasmic membrane. Electron microscopy images of bacterial complex I showed L‑shaped molecules with one arm embedded into the membrane and a peripheral arm that is exposed to the cytoplasm. Complex I from Aquifex aeolicus consists of 13 subunits (called NuoE, F, G, A2, B, D2, H1, I1, J1, K1, L1, M1 and N1) and contains one FMN and ten Fe-S clusters as cofactors. The NADH dehydrogenase fragment contains the subunits NuoE, F and G and is the main entrance point of electrons into the respiratory chain. The subcomplex NuoEF from A. aeolicus has a molecular mass of 66 kDa and contains the NADH binding-site, the cofactor FMN as well as two Fe‑S clusters. The second part of this thesis presents the reduced form of NuoEF that was solved to 2.7 Å resolution. Comparison of the reduced with the oxidised form showed a peptide flip of a conserved residue in the depth of the binding pocket. The reduced form of NuoEF with bound NADH was solved to 2.1 Å resolution, showing the same peptide flip. The function of this peptide flip is not fully understood but it is probably involved in NADH binding and the release of NAD+. Furthermore, structures of NuoEF bound with a strong inhibitor of complex I and with a NAD+ analogue were achieved. The structures were solved to 3.0 Å and 2.0 Å resolution, respectively. The structure of NuoEF with the bound strong inhibitor provided first insights into the structure of the inhibitor which was not examined by X-ray so far.


Kurzfassung in Deutsch

Stickstoff ist ein wichtiger Bestandteil der Synthese von Nukleinsäuren, Aminosäuren und Proteinen Die biochemischen Prozesse von Stickstoff sind fast ausschließlich abhängig von Reduktions-Oxidations-Reaktionen (Redoxreaktionen), die von Mikroorganismen gesteuert werden. Der Stickstoffkreislauf besteht aus mehreren Stoffwechselwegen, von denen jeder einzelne durch Redoxreaktionen beschrieben wird. Das Bakterium Escherichia coli nutzt Nitrat und Ammonium als Stickstoffquelle, welche auf unterschiedlichen Wegen in die Zelle gelangen. Nitrat wird entweder im Periplasma zu Ammonium reduziert und anschließend ins Zytoplasma transportiert oder Nitrat wird zuerst über die Membran transportiert und dann zu Ammonium reduziert. E. coli besitzt drei Nitratreduktasen und zwei Nitritreduktasen, die Nitrat zu Nitrit und anschließend zu Ammonium reduzieren. Außerdem gibt es vier Transportproteine in E. coli, wovon eines für den Ammoniumtransport und drei für den Nitrat- und Nitrittransport verantwortlich sind. Die Nitrat- und Nitrittransporter werden als NarK, NarU and NirC bezeichnet. Nach der Kategorisierung von M. Saier (2000) gehört NarK zur Major‑Facilitator‑Superfamilie (MFS) und ist als aktiver Sekundärtransport klassifiziert, welcher nur mit Hilfe eines elektrochemischen Gradienten funktioniert. Innerhalb dieser Gruppe gehört NarK, wie auch sein Homologe NarU, zur Familie der Nitrat/ Nitrittransporter (NNT). Der Mechanismus von NarK ist noch nicht vollständig geklärt, da es noch keine hochaufgelöste Struktur gibt. In vivo Experimente zeigten, dass NarK sowohl als Nitrat/ Nitrit Antiporter als auch als Nitrat/ Proton Symporter fungiert. Um die Kinetikprozesse von NarK zu untersuchen, wurde das Protein in Liposomenvesikel eingebaut. Die Kinetiken wurden mit einem Stopped-Flow Gerät bestimmt, welches das Quenchen eines Fluoreszenzfarbstoffes aufzeichnet, der im Inneren der Vesikel eingeschlossen ist. Bislang konnten noch keine konstanten Werte für die Reaktionsgeschwindigkeitskonstanten ermittelt werden. Die Ergebnisse sind widersprüchlich, was wahrscheinlich auf die Aggregation von Liposomen zurückzuführen ist. Dieses Problem konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht gelöst werden.

Ein zweites Projekt, beschäftigt sich mit der NADH:Ubichinon Oxidoreduktase, der respiratorische Komplex I, welcher der erste Enzymkomplex der Atmungskette in Mitochondrien und Bakterien ist. Dieses Enzym katalysiert den Transport von zwei Elektronen von NADH zu Ubichinon, welcher mit der Translokation von vier Protonen über die zytoplasmatische Membran verbunden ist. Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigen einen L-förmigen bakteriellen Komplex I, der mit einem Arm in der Membran eingebettet ist und einem zweiten, den sogenannten peripheren Arm, welcher ins Zytoplasma zeigt. Komplex I aus Aquifex aeolicus besitzt 13 Untereinheiten (NuoE, F, G, A2, B, D2, H1, I1, J1, K1, L1, M1 und N1), ein FMN und zehn Fe-S cluster als Kofaktoren. Das NADH Dehydrogenase Fragment enthält die Untereinheiten NuoE, F und G und ist der Haupteintrittspunkt von Elektronen in die Atmungskette. Der Subkomplex NuoEF von A. aeolicus besitzt eine molekulare Masse von 66 kDa und enthält die NADH Bindetasche, das FMN und zwei Fe‑S cluster. Im zweiten Teil dieser Arbeit wird die reduzierte Form von NuoEF mit einer Auflösung von 2.7 Å vorgestellt. Ein Vergleich mit der oxidierten Form zeigte den Peptidflip einer konservierten Aminosäure im Inneren der Bindetasche. Zusätzlich wurde die reduzierte Form mit gebundenem NADH mit einer Auflösung von 2.1 Å gelöst, die ebenfalls diesen Peptidflip zeigt. Die Funktion des Peptidflips konnte noch nicht genau bestimmt werden, aber er ist wahrscheinlich an der NADH Bindung und möglicherweise an der Freisetzung von NAD+ involviert. Weiterhin konnten Strukturen von NuoEF mit einem gebundenen starken Inhibitor von Komplex I und einem NAD+‑Analogon bis zu einer Auflösung von 3.0 Å bzw. 2.0 Å gelöst werden. Dabei konnte ein erster Hinweis auf die Struktur des bislang noch nicht röntgenographisch untersuchten Inhibitors erhalten werden.


SWD-Schlagwörter: NADH-Dehydrogenase <Ubichinon> , Kristallstruktur , Carrier-Proteine , Rekonstitution
Freie Schlagwörter (deutsch): Subkomplex
Freie Schlagwörter (englisch): NADH:ubiquinone oxidoreductase , crystal structure , subcomplex , Major Facilitator Superfamily , Reconstitution
Institut: Institut für Organische Chemie und Biochemie
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Einsle, Oliver (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 29.11.2011
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 16.01.2012
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