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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-84390
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/8439/


Erhardt, Heiko

In vivo Lokalisation der Proteinkomplexe der oxidativen Phosphorylierung und Assemblierung der NADH:Ubichinon Oxidoreduktase in Escherichia coli

In vivo localization of the protein complexes of the oxidative phosphorylation and assembly of the NADH:ubiquinone oxidoreductase in Escherichia coli

Dokument1.pdf (27.705 KB) (md5sum: 306e2e8943e2b3dc34da9430cde75e16)

Kurzfassung in Deutsch

Die Oxidation von energiereichen Stoffewechselintermediaten liefert Reduktionsäquivalente, die bei dem aeroben Elektronentransport durch Sauerstoff oxidiert werden. Dadurch wird ein elektrochemischer Protonengradient über die Membran erzeugt. Hierbei dient Sauerstoff als terminaler Elektronenakzeptor. Die in dem Protonengradienten gespeicherte Energie kann für vielfältige, energie konsumierende Prozesse der Zelle verwendet werden. Wird sie zur Synthese von ATP, dem universellen Energieüberträger genutzt, spricht man von der oxidativen Phosphorylierung (OxPhos). Die oxidative Phosphorylierung wird in Escherichia coli durch eine Serie von integralen Membranproteinkomplexen katalysiert. Aufgrund der Kopplung der Enzymkomplexe über die gleichen Substrate und ihre konzertierte Reaktionsabfolge wird deren gemeinsame Organisation in der cytoplasmatischen Membran diskutiert. Um die OxPhos Proteinkomplexe in vivo zu lokalisieren, wurden in dieser Arbeit fluoreszenzmarkierte Varianten dieser Komplexe hergestellt. Die genetische Information für die Fusionsproteine wurde in das Chromosom eines E. coli K-12 Derivats integriert. Für den effizienten Austausch von unmarkierten DNA-Sequenzen im E. coli Chromosom wurde die λ-Red vermittelte Rekombination verwendet. Um eine physiologische Relevanz der in vivo Untersuchungen zu gewährleisten, wurde überprüft, dass die Fusionsproteine weiterhin als aktive, vollständig assemblierte und stabile Komplexe vorliegen. Es wurde dadurch ein System etabliert, mit dem es möglich ist, die Komplexe der OxPhos in E. coli unter physiologischen Bedingungen fluoreszenzmikroskopisch zu untersuchen. Dies verhindert mögliche artifizielle Lokalisationsmuster, wie sie durch Überproduktion von Proteinen entstehen können. Messungen der Epifluoreszenz belegen die Membranlokalisation aller dargestellten fluoreszierenden Komplexe. Mittels TIRF- und FRAP-Methoden wurde eine unregelmäßige, dynamische Organisation der Komplexe in der cytoplasmatischen Membran beobachtet. Die Lokalisationsmuster der OxPhos Komplexe und deren Dynamik ähneln sich und lassen eine variable Domänenstruktur der beobachteten Komplexe in der Membran vermuten. Weiterhin ermöglichen die Stämme, die in dieser Arbeit hergestellt wurden, in zukünftigen Untersuchungen Kolokalisationsexperimente der fluoreszenmarkierten OxPhos Komplexe. Hierfür wurden Stämme dargestellt, die jeweils zwei chromosomal kodierte OxPhos Komplexe als fluoreszierende Fusionsproteine produzieren.

Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Assemblierung der E. coli NADH:Ubichinon Oxidoreduktase, des respiratorischen Komplex I, untersucht. Dieser Proteinkomplex mit einer molekularen Masse von 535 kDa weist einen komplexen Aufbau aus 13 verschiedenen Untereinheiten und 10 Kofaktoren auf. Er katalysiert die Oxidation von NADH und die Reduktion von Ubichinon, die mit einer Protonentranslokation gekoppelt ist. Bei der Aufreinigung einer Variante des Komplexes ohne die membranständige Untereinheit NuoL wurden zwei Populationen erhalten. Eine aktive Population enthielt alle Kofaktoren und Untereinheiten bis auf NuoL. Der zweiten inaktiven Population fehlte ein Kofaktor, das Eisen Schwefel Zentrum N2. Weiterhin wurde in dieser Population ein weiteres cytoplasmatisches Protein nachgewiesen, die induzierbare Lysin Decarboxylase (LdcI). Es wurde vermutet, dass die LdcI an der Assemblierung des Komplex I in E. coli beteiligt ist. Um dies zu überprüfen, wurde in dieser Arbeit ein E. coli Stamm ohne LdcI hergestellt. Die Präparation des überproduzierten Komplexes und die Überproduktion der ∆NuoL Variante in diesem Stamm zeigten keine erkennbaren Unterschiede zu der Präparation der überproduzierten Proteine in einem Stamm mit LdcI. In vivo FRET Messungen zeigten aber eine eindeutige Wechselwirkung der LdcI mit der ∆NuoL Variante. Um zu untersuchen ob die physiologische Produktion des Komplex I von dem Fehlen der LdcI beeinflusst wird, wurde in dieser Arbeit ein E. coli Stamm hergestellt, in dem der chromosomal kodierte Komplex I mit einem Hexahistidin Affinitätspeptid fusioniert ist, was die Proteinaufreinigung mittels Affinitäts Chromatographie erlaubt. Die Aufreinigung des Komplex I aus diesem Stamm zeigte eine substöchiometrische Assoziation der LdcI an den Komplex. Ausgehend von diesem Stamm war es möglich, weitere Deletionen einzuführen und den Komplex aus diesen Doppelmutanten effizient aufzureinigen. Es zeigte sich, dass der Verlust der LdcI die Assemblierung des Komplexes auf eine bislang unbekannte Art und Weise verändert. Die eigentliche Natur der Interaktion zwischen Komplex I und LdcI bleibt somit weiterhin unklar. Die Produktion und Aufreinigung des Komplex I aus weiteren Doppelmutanten zeigte, dass die Deletion von RavA, einem Mitglied der AAA+-ATPasen, ebenfalls zu einem teilweisen Verlust des Einbaus des Eisen Schwefel Zentrums N2 führt.


Kurzfassung in Englisch

The oxidation of high energy central metabolic intermediates produces reduction equivalents, which can be oxidized through aerobic electron transport. This gives rise to an electrochemical proton gradient across the membrane, whereas oxygen serves as final electron acceptor. The energy conserved in the proton gradient can be used to drive various energy consuming processes within the cell. When this energy serves to synthesize ATP - the universal transmitter of energy - the process is called oxidative phosphorylation (OxPhos). The oxidative phosphorylation in Escherichia coli is catalyzed by a series of integral membrane proteins. Because the enzyme complexes share the same substrates and perform a concerted reaction sequence, a common organization within the cytoplasmatic membrane is discussed. To perform in vivo localization experiments of the OxPhos protein complexes this work established fluorescent labeled variants of these complexes. The genetic information for the fusion proteins was integrated in the chromosome of an E. coli K-12 derivate. To ensure an efficient exchange of unmarked DNA sequences in the E. coli chromosome, the λ-Red mediated recombination system was used. To guarantee a physiological relevance of the in vivo experiments, it was examined that the fusion proteins were present as active, fully assembled and stable complexes. Thus a system was established, which allows to observe the E. coli OxPhos complexes under physiological conditions with fluorescence microscopy methods. This prevents potentially artificial localization patterns, often evoked through protein overproduction. Epifluorescence measurements showed clear membrane localization of all engineered fluorescent complexes. Via TIRF- und FRAP-methods an uneven, dynamic organization of the complexes was observed. The localization patterns of the OxPhos complexes and their dynamic were similar to each other and suggest a variable domain structure of the examined complexes in the membrane. Furthermore the strains created in this work, enable co-localization experiments of the fluorescent labeled OxPhos complexes. To address this question, strains were created which are producing two OxPhos complexes as chromosomally encoded fluorescent variants.

In a second part of this work, the assembly process of the E. coli NADH:ubiquinone oxidoreductase, the respiratory complex I, was examined. This protein complex with a molecular mass of 535 kDa shows a complex composition made of 13 different subunits and 10 cofactors. It catalyzes the oxidation of NADH and the reduction of ubiquinone, which are coupled with a proton translocation. In the course of protein purification of a complex variant without the membrane bound subunit NuoL two different populations were obtained. An active population contained all cofactors and subunits except NuoL. A second inactive population was lacking one cofactor, the distal iron-sulfur center N2. Furthermore this population was associated with an additional cytoplasmatic protein, the inducible lysine decarboxylase (LdcI). It was assumed, that the LdcI is involved in the assembly processes of complex I from E. coli. To address this question an E. coli strain lacking the gene for LdcI was created in this work. The preparation of the overproduced complex and the overproduction of the ∆NuoL variant in this strain showed no recognizable differences compared to the preparation of the respective proteins in an LdcI containing strain. In addition in vivo FRET measurements gave clear evidence of an interaction of the LdcI with the ∆NuoL variant. The question arose, if the physiological production of complex I is influenced by the absence of LdcI. To answer this question, an E. coli strain with a chromosomal encoded hexahistidin affinity peptide fused to complex I was created, to allow the protein purification via affinity chromatography. The complex I purification of this strain showed a substoichiometrically association of LdcI with the complex. Based on this strain it was possible to introduce further deletions and to efficiently purify the complex out of this double mutant strains. It was shown that the lack of LdcI influences the assembly of the complex in a so far unknown way. The very nature of this interaction between complex I and the LdcI remains unclear. Production and purification of complex I from additional double mutants showed, that the deletion of RavA, a member of the AAA+-ATPases also leads to a partial loss of the iron-sulfur center N2.


SWD-Schlagwörter: NADH-Dehydrogenase <Ubichinon> , Fluoreszenzmikroskopie , Membranproteine , Homologe Rekombination , Oxidative Phosphorylierung
Freie Schlagwörter (deutsch): Escherichia coli , in vivo Lokalisation
Freie Schlagwörter (englisch): oxidative phosphorylation , NADH:ubiquinone oxidoreductase , fluorescence microscopy , in vivo localization , Escherichia coli
Institut: Institut für Organische Chemie und Biochemie
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Friedrich, Thorsten (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 15.12.2011
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 23.01.2012
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