Direkt zum Inhalt | Direkt zur Navigation

Eingang zum Volltext

Lizenz

Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-84426
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/8442/


Glessner, Udo

Ortsgerichtete Spinsondenmarkierung der Escherichia coli NADH:Ubichinon Oxidoreduktase zur ESR-spektroskopischen Lokalisierung der Ubichinonbindestelle

Site-directed spin labeling of the Escherichia coli NADH:ubiquinone oxidoreductase for localizing the ubiquinone binding site by means of EPR-spectroscopy

Dokument1.pdf (4.054 KB) (md5sum: 3f644425dfec181fd70e761da5d943d6)

Kurzfassung in Deutsch

Die NADH:Ubichinon Oxidoreduktase, der sogenannte Atmungskettenkomplex I, ist in der Cytoplasmamembran vieler Prokaryonten und in der inneren Mitochondrienmembran der meisten Eukaryonten lokalisiert. Sie ist das erste einer Reihe von membrangebundenen Enzymkomplexen, die den Elektronentransfer von NADH auf Sauerstoff katalysieren. Komplex I koppelt die Übertragung von zwei Elektronen von NADH auf Ubichinon mit der Translokation von vier Protonen über die Membran und trägt so zur Erzeugung eines Protonengradienten bei, der Triebkraft für energieverbrauchende Reaktionen ist. Der Komplex I aus dem Bakterium Escherichia coli besteht aus 13 Untereinheiten, die eine Gesamtmasse von 535 kDa ergeben. Der Komplex trägt neun Eisen-Schwefel (Fe/S)-Zentren und ein Flavinmononukleotid als Kofaktoren für den Elektronentransfer. Die Röntgenstruktur des Komplexes aus Thermus thermophilus zeigte Details über den Aufbau des Proteinkomplexes und erlaubte Aussagen zum Elektronentransfer und zur Protonentranslokation. Da in der Struktur aber kein gebundenes Ubichinon zu erkennen ist, ist die Position des terminalen Elektronenakzeptors Ubichinon weiterhin unbekannt. ESR-spektropische Messungen an Komplex I aus Rinderherzmitochondrien gaben Hinweise auf zwei Semichinonspezies in Komplex I. Ob diese tatsächlich zwei getrennte Moleküle oder aber zwei Zustände desselben Moleküls repräsentieren, ist umstritten. Für die polare Kopfgruppe des Chinons wurde anhand von Mutagenesestudien am Komplex I aus der Hefe Yarrowia lipolytica ein konservierter Tyrosinrest nahe des terminalen Fe/S-Zentrums N2 als wahrscheinlicher Bindungspartner vorgeschlagen.
In dieser Arbeit sollte die Ubichinonbindestelle des Komplex I aus E. coli ESR-spektroskopisch bestimmt werden. Dazu wurden mit Hilfe der ortsgerichteten Mutagenese und der Lambda-Red vermittelten Rekombination Cysteinreste auf der Oberfläche des Komplex I generiert. Das mutagenisierte nuo-Operon, das die Strukturgene des Komplex I kodiert, wurde überexprimiert und die überproduzierten Varianten durch chromatographische Methoden präpariert. Die Präparationen wurden mit einem reaktiven Fluoreszenzfarbstoff auf die Zugänglichkeit der Modifikation überprüft. Markierbare Positionen wurden mit der MTSL-Spinsonde markiert. Weiterhin wurde eine zweite Spinsonde in Form des spinsondenmarkierten Substratderivats MTSL-Decylubichinon eingebracht. Die markierten Proteine wurden mit dem markierten Substrat gemischt und in einer Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Weber, Physikalisch-chemisches Institut der Universität Freiburg, durch gepulste ESR-spektroskopische Messungen untersucht. Durch Auswertung der Spin-Spin-Wechselwirkungen wurden Abstände im Bereich von etwa 20 bis 45 Å zwischen den beiden Spinsonden gemessen. Für kürzere Abstände wurden auch cw-ESR-spektroskopische Methoden benutzt. Hier wurde aus der Verbreiterung des Spektrums aufgrund der dipolaren Wechselwirkung zwischen den Spins der Abstand zwischen den Spinsonden ermittelt. Die ermittelten Abstände wurden genutzt, um die Position des gebundenen Elektronenakzeptors Ubichinon abzuschätzen.


Kurzfassung in Englisch

The NADH:ubiquinone oxidoreductase, the respiratory complex I, is localized in the cytoplasmic membrane of many prokaryotes and in the inner mitochondrial membrane of most eukaryotes, respectively. It ist he first member of a series of membrane-bound enzyme complexes, which catalyze the electron transfer from NADH to oxygen. Complex I couples the transfer of two electrons from NADH to ubiquinone with the translocation of four protons across the membrane and thus contributes to the generation of a proton gradient, which drives energy consuming processes. Complex I from the bacterium Escherichia coli consists of 13 subunits with a total mass of 535 kDa. The complex contains nine iron sulfur (Fe/S) clusters and one flavinmonocluceotide as cofactors for the electron transfer. The X-ray structure of the complex from Thermus thermophilus revealed details of its construction and allowed for conclusions concerning electron transfer and proton translocation. As in the structure no bound ubiquinone is resolved, the position of the terminal electron acceptor ubiquinone remains unknown. EPR-spectroscopic measurements on bovine complex I provided indication of two semiquinone species in complex I. It is under dispute if these two species indeed derive from two different molecules or if they represent two states of the same molecule. On the basis of mutational studies on complex I from the yeast Yarrowia lipolytica, a conserved tyrosine residue near the terminal Fe/S cluster N2 was proposed as presumable binding partner for the polar head group of the quinone.
In this work, the ubiquinone binding site in the E. coli complex I was to be determined by means of EPR spectroscopy. For that purpose, cysteine residues on the surface of complex I were generated by means of site-directed mutagenesis and lambda-red mediated recombineering. The mutated nuo operon containing the structural genes of complex I was overexpressed and the overproduced variants were prepared by chromatographical methods. The preparations were checked for the accessibility of the modification using a reactive flourescent dye. Positions which were accessible were labeled with the MTSL spin label. Furthermore, the labeled substrate derivative MTSL-decylubiquinone was used as a second spin label. The labeled protein was mixed with the labeled substrate and examined by pulsed EPR spectroscopy, which was done in a cooperation with the group of Prof. Dr. Weber in the physical chemistry department of the University of Freiburg. By investigating the spin-spin interactions, distances from about 20 to 45 Å between the spin labels were measured. For shorter distances, cw EPR spectroscopy was used. Here, the distances were derived from the broadening of the spectrum due to the dipolar interactions of the spins. The obtained distances were used to estimate the position of the bound electron acceptor ubiquinone.


SWD-Schlagwörter: NADH-Dehydrogenase <Ubichinon> , Escherichia coli , Elektronenspinresonanzspektroskopie , Spin-Sonde , Ortspezifische Mutagenese
Freie Schlagwörter (deutsch): Homologe Rekombination
Freie Schlagwörter (englisch): Complex I , E. coli , spin label , mutagenesis, recombineering
Institut: Institut für Organische Chemie und Biochemie
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Friedrich, Thorsten (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 20.12.2011
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 23.01.2012
Indexliste