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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-84691
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/8469/


Gantert, Carla

Untersuchungen zur biokatalytischen Reduktion alpha,beta-ungesättigter Carbonylverbindungen, Die hydrolytische Oxepin-CoA-Ringspaltung des aeroben Phenylessigsäure-Stoffwechsels

Biocatalytic reduction of alpha,beta-unsaturated carbonyl compounds, The hydrolytic Oxepin-CoA ring cleavage of the aerob phenylacetic acid metabolism

Dokument1.pdf (5.180 KB) (md5sum: c814eebc10791d96c21d080353195521)

Kurzfassung in Deutsch

Teil 1:
Im ersten Teil der Arbeit wurde die enzymatische, chemoselektive Reduktion der Doppelbindung alpha,beta-ungesättigter Carbonylverbindungen mit der NAD(P)H abhängigen Alkenal/ol Oxidoreduktase (AOR) der Ratte gezeigt. Es wurde ein umfassendes Substratscreening durchgeführt, bei dem die AOR ein sehr breites Substratspektrum zeigte. Das Enzym weist bei der Reduktion alpha-substituierten alpha,beta-ungesättigten Carbonylverbindungen eine geringe Stereoselektivität auf. Durch Röntgenstrukturanalyse konnte die atomare Struktur der AOR aufgeklärt werden. Basierend auf diesen Daten wurden durch rationales Proteindesign Mutantionsvorschläge erstellt, mit dem Ziel die Stereoselektivität der Reduktionen positiv zu beeinflussen. In einem weiteren Teil der Arbeit wurden Untersuchungen mit der Pferdeleber-Alkohol-Dehydrogenase (HL-ADH) durchgeführt. Normalerweise katalysiert sie die Reduktion von Carbonylgruppen, meist enantioselektiv zu den entsprechenden Alkoholen. In der vorliegenden Arbeit wurde bei einer aromatischen alpha,beta-ungesättigten Carbonylverbindung die Reduktion der C=C-Doppelbindung mit der HL-ADH festgestellt und näher untersucht. Im letzten Teil dieses Abschnitts sollte die in vivo Funktion des als Chinon-Oxidoreduktase deklarierten Enzyms in Escherichia coli QOREc untersucht werden. Die hergestellte qor-Knock out Mutante zeigte im Vergleich zum Wildtyp unter vielen getesteten Bedingungen keinen veränderten Phänotyp, so dass es nicht möglich war auf diesem Weg die physiologische Funktion der QOREc aufzuklären. Um die spezifischen Enzymaktivitäten zu bestimmen, wurden die QOREc und die Chinon-Oxidoreduktase aus Thermus thermophilus (QORTt) rekombinant gewonnen. Es zeigte sich, dass beide Enzyme sowohl Chinone zu Hydrochinonen, als auch chemoselektiv die C=C-Doppelbindung eines alpha,beta-ungesättigten Ketons reduzieren. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die QOREc und die QORTt substratabhängig Ein- oder Zwei-Elektronen-Reduktionen katalysieren.

Teil 2:
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden zwei zentrale Schritte des Phenylessigsäure-Abbaus, die hydrolytische Ringspaltung des heptazyklischen Enolethers Oxepin-CoA zum offenkettigen Aldehyd und dessen Oxidation zur Säure, näher untersucht. In vielen Organismen werden diese Reaktionen durch ein bifunktionelles Fusionsprotein katalysiert, bestehend aus einer Enoyl-CoA-Hydratase (ECH)-Domäne (erster Schritt) und einer Aldehyd-Dehydrogenase (ALDH)-Domäne (zweiter Schritt). Die Hälfte aller Organismen, die über konservierte Gene des Phenylessigsäure-Stoffwechsels verfügen, hat kein solches Fusionsprotein. Stattdessen findet man lediglich ein Gen, das für eine ALDH kodiert. Ziel der Arbeit war es aufzuklären, wie Organismen, die über kein Fusionsprotein verfügen, die hydrolytische Ringspaltung des Oxepin-CoA katalysieren. Für die Versuche wurde Aromatoleum aromaticum verwendet. In dessen Genom wurde außerhalb des Genclusters für den Phenylessigsäure-Abbau ein ech-Gen gefunden, dessen Genprodukt in Kombination mit der ALDH des Clusters die analoge Reaktion des Fusionsproteins katalysiert. Das vermutete Zwischenprodukt dieser Reaktion, der Aldehyd, konnte nicht identifiziert werden, da er offenbar sofort intramolekular weiterreagiert. So entsteht ein stabiles zyklisches Derivat, welches isoliert und identifiziert wurde. Dieses zyklische Derivat stellt in anderen Organismen vermutlich ein Ausgangssubstrat für die Synthese wichtiger Primär- und Sekundärmetabolite dar. Die in dieser Arbeit beschriebene Ringspaltung des Oxepin-CoA stellt somit einen wichtigen metabolischen Verzweigungspunkt dar.


Kurzfassung in Englisch

Part 1:
In the first part of this work the chemoselective reduction of the double bond of alpha,beta-unsaturated carbonyl compounds by NAD(P)H-dependent alkenal / ol oxidoreductase (AOR) of the rat was shown. A comprehensive substrate screening was conducted, where the AOR showed a broad substrate spectrum. In the reduction of alpha-substituted alpha,beta-unsaturated carbonyl compounds the enzyme only shows a low stereoselectivity. By X-ray structure analysis, the atomic structure of the AOR was elucidated. Based on these data mutants were created by rational protein design, with the aim to positively influence the stereoselectivity of the reductions. Additionally experiments were performed with horse liver alcohol dehydrogenase (HL-ADH). Usually, it catalyzes the reduction of carbonyls to the corresponding alcohols. In the present study the additional reduction of the double bond of an alpha,beta-unsaturated keton was observed and further examined. Furthermore the in vivo function of the soluble quinone oxidoreductase in Escherichia coli QOREc was examined. The phenotype of the produced Δqor knock out mutant was compared to the wild type under many tested conditions but no altered phenotype was observed. So it was not possible to elucidate the physiological function of the QOREc. To determine specific enzyme activities QOREc and the quinone oxidoreductase from Thermus thermophilus (QORTt) were derived recombinantly. It was found that both enzymes catalyze the reduction of quinones to hydroquinones as well as the chemoselective reduction of the C = C double bond of an alpha,beta-unsaturated ketone. Furthermore, it was shown that the QOREc and QORTt catalyze substrate-dependent one-or two-electron reductions.

Part 2:
In the second part of this work two key steps of the phenylacetic acid (paa) degradation were examined in detail: the hydrolytic ring cleavage of oxepin-CoA to the open-chain aldehyde and its oxidation to the corresponding acid. In many organisms, these reactions are catalyzed by a bifunctional fusion protein consisting of an enoyl-CoA hydratase (ECH) domain (first step) and an aldehyde dehydrogenase (ALDH) domain (second step). In half of phenylacetate utilizing bacteria the genes for the pathway exist in a cluster that contains the gene of an ALDH while the gene of the aldehyde producing hydratase is missing. The aim of this study was to elucidate how these organisms catalyze the above-named two-step reaction. For these experiments Aromatoleum aromaticum was used. A gene outside the gene cluster could be found, whose gene product in combination with the ALDH catalyzes the fusion protein analog reaction. The presumed intermediate of this reaction, the aldehyde could not be identified. If it did not oxidize immediately the reactive aldehyde condenses intramolecularly to a stable cyclic derivative. In other organisms this derivative probably serves as a starting substrate for the synthesis of important primary and secondary metabolites. The hydrolytic ring cleavage of oxepin-CoA therefore serves as an important metabolic branch point.


SWD-Schlagwörter: Enzymkatalyse , Phenylessigsäure , Stoffwechsel
Freie Schlagwörter (englisch): biocatalysis , aerob phenylacetic acid metabolism
Institut 1: Institut für Biologie 2
Institut 2: Institut für Pharmazeutische Wissenschaften
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Müller, Michael (Prof. Dr.)
Quelle: R. Teufel, C. Gantert, M. Voss, W. Eisenreich, W. Haehnel, G. Fuchs; Studies on the Mechanism of Ring Hydrolysis in Phenylacetate Degradation: A metabolic branching point, J. Biol. Chem. 2011, 286, 11021.(
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 09.02.2012
Erstellungsjahr: 2012
Publikationsdatum: 23.02.2012
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