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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-85046
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/8504/


Wohlfarth, Ariane

Pharmakokinetik und Metabolismus von delta9-Tetrahydrocannabinolsäure A im Menschen

Pharmacokinetics and metabolism of delta9-tetrahydrocannabinolic acid A in humans

Dokument1.pdf (1.239 KB) (md5sum: 9e7cd06eab01be18b7dc26ef91e663d6)

Kurzfassung in Deutsch

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die pharmakokinetischen Eigenschaften von delta9-Tetrahydrocannabinolsäure A (THCA) und ihren Metabolismus im Menschen aufzuklären. Ausgangspunkt war die These, dass THCA – die nicht psychoaktive, biogenetische Vorläufersubstanz von THC in der Cannabispflanze – ein Marker für kurz zurückliegenden Cannabiskonsum sein könnte. Ein solcher Marker wäre hilfreich, um einen akuten Cannabiseffekt anhand von Blut- oder Urinproben nachzuweisen, was bis heute ein Problem in der forensischen Praxis darstellt.
Kernstück der Arbeit war eine Humanstudie mit 16 Probanden, die THCA oral und intravenös erhielten. Dafür waren im Vorfeld einige Vorarbeiten nötig: Um auf Enzymaktivitäten beruhende Unterschiede in der Pharmakokinetik zu erkennen, wurde als erstes eine Cocktail-Phänotypisierungsmethode für die fünf CYP-Isoenzyme 1A2, 2C9, 2C19, 2D6 und 3A4 entwickelt. Neben der Auswahl der Testsubstanzen, der Phänotypisierungsindices und eines Probennahmeschemas umfasste dieser Schritt auch die Entwicklung und Validierung einer effektiven Aufbereitungsmethode und einer empfindlichen Analysenmethode. Die für die Humanstudie benötigte THCA wurde mittels Flash-Chromatographie aus Cannabisrohmaterial isoliert. Mit zwei voneinander unabhängigen Systemen konnte schließlich hochreine THCA (Reinheit > 98,5%) gewonnen werden, die zur Herstellung der Prüfpräparate diente. Als Grundlage für die intravenöse Applikation der lipophilen und thermoinstabilen THCA erwies sich eine parenterale Fettemulsion als geeignet. Letzter Schritt war die Entwicklung einer ESI-LC-MS/MS-Methode zum empfindlichen Nachweis von THCA und ihren Metaboliten sowie die Validierung der Quantifizierungsmethode für THCA. Im Fokus standen die Optimierung der Probenaufbereitung mittels Proteinfällung und eine kurze Analysendauer.
Die Humanstudie selbst war in zwei Teile unterteilt: Im ersten Abschnitt erhielten die Probanden 10 mg THCA oral, im zweiten 5 mg intravenös und gaben jeweils über 96 h Blut- und Urinproben ab. Die Phänotypisierung erfolgte zwischen beiden Abschnitten. Mit einer Nachweisgrenze von 0,1 ng/ml stellte sich bei der Messung der Proben schließlich heraus, dass THCA bei den meisten Probanden bis zur letzten Serumprobe nachweisbar ist. Im Urin fanden sich nur minimale THCA-Mengen, eine Umwandlung in vivo von THCA zu THC im Körper fand nicht statt.
Es erfolgte eine pharmakokinetische Analyse gemäß den Prinzipien der „compartmental“ und der „non-compartmental analysis“, mit der erstmals grundlegende pharmakokinetische Parameter der THCA (AUC, Clearance, Verteilungsvolumina, Halbwertzeiten sowie Makro- und Mikrokonstanten des Kompartimentmodells) bestimmt wurden. Dabei zeigte sich, dass die Pharmakokinetik von THCA am besten durch ein Drei-Kompartimentmodell beschrieben werden kann, was auf die Existenz eines tiefen Kompartiments deutet. Die meisten Parameter ähnelten prinzipiell denen von THC. Der einzige fundamentale Unterschied zu THC war die Plasmaclearance, die für THCA zehnfach geringer ist als für THC. Die orale Bioverfügbarkeit lag bei ~ 40 %.
Es bestätigte sich, dass der Metabolismus von THCA analog zu THC verläuft. Hauptmetabolite im Serum sind 11-OH-THCA, THCA-8-on und THCA-COOH-Glucuronid, THCA-COOH sowie 9,10 Bis-OH-Hexahydrocannabinolsäure A (HHCA). Wie zu erwarten war, sind die Hauptmetabolite im Urin vor allem Glucuronide, wobei THCA-COOH-Glucuronid, 11-OH-THCA-Glucuronid, 8- und 4’-OH-THCA-COOH-Glucuronid die intensivsten Signale lieferten. Oft fand sich bis zur letzten abgegebenen Urinprobe wie auch im Serum unglucuronidierte 9,10-Bis-OH-HHCA. Zusätzlich wurde ein in vitro Experiment mit isolierten CYP-Isoenzymen durchgeführt, in dem sich herausstellte, dass vor allem die drei CYP 450-Isoenzyme 2C9, 3A4 und 2C19 beim Abbau von THCA eine Rolle spielen. In einer statistischen Analyse wurden schließlich die aus der Phänotypisierungsstudie ermittelten Indices mit den THCA-Clearances korreliert und untersucht, ob sich weitere Hinweise auf die abbauenden Isoenzyme ergeben. Für CYP 3A4 ließ sich ein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen Enzymaktivität und Clearance bestätigen, für alle anderen Kombinationen war dies jedoch nicht möglich.
Die Hypothese, THCA könnte als Marker für kurzzeitig zurückliegenden Cannabiskonsum dienen, bestätigte sich nicht. Dieser Anwendung steht die Umverteilung in ein tiefes Kompartiment entgegen, was zu Akkumulation und langer Nachweisbarkeit führt. Hilfreich für ein anderes Konzept könnten jedoch einige THCA-Metaboliten werden. Dieses Konzept verfolgt den Ansatz, verschiedene Cannabisinhaltsstoffe und nachrangig gebildete Metaboliten zu screenen und daraus Schlüsse über Konsumzeitpunkt und letztendlich den Effekt zu ziehen. In dieses Substanzspektrum könnten Metaboliten wie THCA-Glucuronid, 8alpha- bzw. 8beta-OH-THCA, 8,11-Bis-OH-THCA sowie 8- bzw. 4’-OH-THCA-COOH-Glucuronid, die sich bei allen Probanden nur kurz nach der Applikation fanden, eingeschlossen werden.


Kurzfassung in Englisch

This dissertation deals with the human pharmacokinetics and metabolism of delta9-tetrahydrocannabinolic acid A (THCA), the non-psychoactive, biogenetic precursor of THC in Cannabis. The investigation was motivated by the assumption that THCA might be a marker for recent Cannabis use and could help to prove an acute Cannabis effect by analysing blood or urine samples.
The principal part of the thesis was a study with 16 volunteers who where administered THCA orally and intravenously. In the forefront of this study several preparation steps were necessary:
First, a cocktail method for phenotyping of five major CYP isoenzymes was developed in order to later identify polymorphism-caused differences in THCA pharmacokinetics. The method comprised the five most relevant CYP isoenzymes for xenobiotic metabolism - 1A2, 2C9, 2C19, 2D6 und 3A4. After selection of the probe substances, determination of phenotyping indices and establishment of a sampling schedule, an comprehensive preparation procedure (solid phase extraction) and a sensitive analytical method (ESI-LC-MS/MS) targeting all compounds of interest were developed and validated.
For the study several milligrams of THCA were required. They were isolated from raw Cannabis extract by flash chromatography using two new, rapid and independent procedures. THCA with a purity grade higher 98.5 % was obtained which served for preparation of the capsules and the intravenous drug formulation. For the latter a fat emulsion for parenteral nutrition turned out to be a suitable basis for the application of the lipophilic and thermolabile THCA.
The last preparation step was the development of a sensitive analytical method (ESI-LC-MS/MS) for quantification of THCA as well as for the detection of THCA metabolites. Focus was laid on the optimization of the protein precipitation procedure and a short run-time. The quantification method for THCA was validated according to forensic guidelines.
The study was divided in two sessions. During the first session the volunteers were administered 10 mg THCA orally, during the second one 5 mg THCA intravenously. The phenotyping took place in between. After application blood and urine samples were collected up to 96 hours. The analytical method was sensitive enough (limit of detection 0.1 ng/mL) to detect trace amounts of THCA and it could be shown that in almost all 96-hour-serum-samples THCA was present. In urine only minimal amounts of THCA were found. No in vivo transformation of THCA into THC occurred.
The concentration-time-data was submitted to a compartmental and a non-compartmental analysis yielding basic pharmacokinetic parameters for THCA (AUC, plasma clearance, volumes of distribution, half-lives, macro and micro constants of the compartment model) for the first time. An important finding was that THCA pharmacokinetics can best be described by a three-compartment-model implying the presence of a deep compartment from which THCA is eliminated with a long half-life. Most pharmacokinetic parameters were similar or in the same range of magnitude as those of THC. The only fundamental difference was the plasma clearance being ten fold lower for THCA. Oral bioavailability was ~ 40 %.
THCA metabolism proved to be in analogy to THC. Main metabolites in serum were: 11-OH-THCA, THCA-8-on, THCA-COOH-glucuronide, THCA-COOH as well as 9,10-bis-OH-hexahydrocannabinolic acid A (HHCA). As expected, glucuronides were the major metabolites in urine: The most intensive signals were produced by THCA-COOH-glucuronide, 11-OH-THCA-glucuronide, 8- and 4’-OH-THCA-COOH-glucuronide. Unglucuronated 9,10-bis-OH-HHCA could still be found after a long time period.
Furthermore, an in vitro experiment with single isoenzymes was conducted and revealed that CYP 2C9, 3A4 and 2C19 play a major role in THCA biotransformation.
Additionally, a statistical analysis was carried out correlating phenotyping indices with THCA plasma clearances in order to further confirm the involvement of single isoenzymes in THCA metabolism. For CYP 3A4 a significant correlation between enzyme activities and clearance could be disclosed whereas all the other combinations showed no significant relationship.
The hypothesis that THCA might be a Cannabis consumption marker in the future has to be rejected. Due to its distribution in a third, deep compartment THCA accumulates resulting in a long detection window. However, several THCA metabolites could be useful regarding to another strategy of evaluating Cannabis impairment. This concept adopts the approach of screening different Cannabis compounds and minor metabolites to draw conclusions about time of consumption and, eventually, the effect. Minor THCA metabolites like THCA glucuronide, 8alpha- and. 8beta-OH-THCA, 8,11-bis-OH-THCA as well as 8- and 4’-OH-THCA-COOH glucuronide that were found only shortly after application could be valuable compounds in this screening spectrum.


SWD-Schlagwörter: Pharmakokinetik , Metabolismus
Freie Schlagwörter (deutsch): Cannabis , Tetrahydrocannabinolsäure A , LC-MS/MS
Freie Schlagwörter (englisch): pharmacokinetics , metabolism , Cannabis , delta9-tetrahydrocannabinolic acid A , LC-MS/MS
Institut: Institut für Pharmazeutische Wissenschaften
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Schubert, Rolf (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 09.02.2012
Erstellungsjahr: 2012
Publikationsdatum: 05.03.2012
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