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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-85259
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/8525/


Geers, Stefanie

Control of initiation of replication and identification of enzymes mediating DNA break repair in Bacillus subtilis

Kontrolle der Initiation der Replikation und Identifizierung von in DNA Reparaturprozessen involvierten Enzymen in Bacillus subtilis

Dokument1.pdf (2.617 KB) (md5sum: 16a0c69bffc91562da2e9895af9288e7)

Kurzfassung in Deutsch

Initiation der Replikation
Die Replikation von DNA ist ein komplexer und streng regulierter Prozess, welche für die Zellteilung in allen Zellen notwendig ist. Während eines Zellzyklus duplizieren die Zellen ihr Genom und dieser Vorgang muss genauestens überwacht und reguliert werden, um die korrekte Replikation zum entsprechenden Zeitpunkt zu gewährleisten und dies nur einmal pro Zellzyklus.
In Bacillus subtilis beginnt die Replikation des Chromosoms am Replikationsursprung, der sogenannte oriC, und wird eingeleitet über das Initiatorprotein DnaA, welches an eine Region des Replikationsursprunges bindet, die DnaA-Boxen. In vorangegangenen Arbeiten wurde gezeigt, dass YabA ein negativer Regulator der Initiation ist und die Abwesenheit von YabA ein starkes Ausmaß auf die Initiation der Replikation hat. Diese Zellen überinitiieren und besitzen multiple Kopien der Initiationsregion.
Einige Untersuchungen ließen den Schluss zu, dass Soj und Spo0J mit DnaA interagieren und eine bedeutende Rollen während der Regulation der Initiation spielen. Soj und Spo0J aus Bacillus subtilis gehören zu einer konservierten Proteinfamilie, dem par-Operon, welches für eine effiziente Plasmid und Chromosomenpartitionierung in vielen Bakterien verantwortlich ist. In Δsoj, Δspo0J und Δ(soj-spo0J) Zellen wurden die Replikation und Ursprungsposition analysiert. Alle Mutanten wiesen eine erhöhte Initiation der Replikation auf und zu einem bestimmten Grad auch eine Beeinträchtigung der Ursprungspositionierung, ähnlich dem Phänotyp des ΔyabA-Stammes.
Ziel dieser Arbeit war der Einfluss von Δ(soj-spo0J) auf das Initiatorprotein DnaA. Dafür wurde ein Stamm mit YFP-DnaA und Δ(soj-spo0J) generiert. Die Zellen wurden mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Ein weiterer Ansatz fokussierte auf die biochemische Untersuchung der Interaktion. Dafür wurden DnaA und Soj in einen pET-Duet-Vektor kloniert und in E. coli rosetta überexprimiert. Die dadurch mit einem His-Tag versehenen Proteine wurden über FPLC aufgereinigt und in identischem Puffer für die SPR-Studien vorbereitet. Die „surface plasmon resonance“ (SPR) Biosensor-Technik liefert wichtige Informationen in Bezug auf die Charakterisierung von Protein-DNA-Interaktionen. Zu diesem Zweck wurde die Ursprungsregion, von 359° bis 0,4° (~670 bp), inklusive der DnaA-Boxen, über Biotin an die Matrix gebunden und anschließend wurde DnaA addiert. DnaA hat an die Ursprungsregion gebunden, jedoch war diese Interaktion abhängig von der An~ bzw Abwesenheit von ATP. Das Zufügen von Soj zu diesem Versuchsaufbau hatte einen signifikanten Effekt auf DnaA. Wurden die beiden Proteine prä-inkubiert und anschließend auf die DNA gegeben, so wurde die Bindungsfähigkeit von DnaA stark beeinträchtigt bzw. herabgesetzt.
Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass eine Deletion von Soj, Spo0J und YabA tödlich für die Zellen ist. Nur durch Zugabe einer großen DNA-Menge konnten Transformanten überleben, die eine reparierte Version von yabA enthielten. Die Ergebnisse dieses Versuchs lassen den Schluss zu, dass es vermutlich nur zwei Hauptregulationen in Bacillus subtilis in Bezug auf die Initiation der Replikation gibt.

Reparatur von DNA-Schäden
Um das Überleben zu sichern müssen alle Zellen die Stabilität ihres Genoms sichern. Unter normalen physiologischen Bedingungen treten häufig diverse Schäden auf, die repariert werden müssen. Nicht reparierte DNA-Schäden können zu Doppelstrang-brüchen führen. Daher haben die Zellen verschiedene Mechanismen entwickelt, um die korrekte Struktur und Information ihrer DNA zu erhalten.
Homologe Rekombination spielt dabei eine große Rolle. In Eukaryoten und Bakterien konnte die Formierung von „Multiprotein Komplexen“ an Doppelstrangbrüchen beobachtet werden. Es hat sich gezeigt, dass in Bacillus subtilis das SMC-ähnliche Protein RecN, RecF und RecO in die DNA Rekombination involviert sind und dort eine wichtige Rolle übernehmen. Zwar wurde das Auftreten dieser Proteine während des Reparaturprozesses schon dokumentiert, jedoch bleibt das Zusammenspiel der Proteine noch unklar.
Ziel dieser Arbeit war das Auffinden unbekannter Interaktionspartner mit Hilfe der „tandem
affinity purification” (TAP) Methode. Diese Technik ermöglicht die Aufreinigung von Komplexen unter native Bedingungen. Für die Aufreinigung von RecN wurden die Zellen mit Mitomycin C induziert, um Doppelstrangbrüche zu regenerieren. Die ersten Ergebnisse der Aufreinigung wurden mittels Massenspektrometrie identifiziert. Gyrase A, eine Typ II Topoisomerase und RecR wurden ermittelt. Basierend auf diesen Ergebnissen wurden mikroskopische Untersuchungen vorgenommen. RecN, RecR und GyrA zeigten spezifische Lokalisationen.
Ein weiterer Ansatz war die Reduktion der Gyrase-Aktivität mittels Novobiocin, ein spezifischer Gyrase-Inhibitor. Die Ergebnisse zeigen, dass die Überlebensrate der Zellen stark abnimmt, wenn die Gyrase gehemmt wird und die Zellen Doppelstrangbrüche aufweisen. Dies deutet darauf hin, dass die Gyrase eine wichtige Rolle während des Reparaturprozesses spielt.


Kurzfassung in Englisch

Initiation of replication

Replication of DNA is a complex and highly regulated process that is required for cell division in all species. During each cell cycle, cells need to duplicate their genome and this needs a tightly regulated process to make sure that DNA is precisely replicated at the appropriate time, only once per cycle.
In Bacillus subtilis replication of the chromosome starts from a single replication origin (oriC) and the replication is initiated by the initiator protein DnaA that binds to a region of the origin, the so called DnaA-boxes. It could be shown that YabA is a negative regulator of initiation and in the absence of YabA, initiation of replication is highly deregulated. Those cells contain multiple origin copies.
Some investigations showed that Soj and Spo0J interact with DnaA and seem to play a crucial role in regulation of the initiation. Soj and Spo0J of Bacillus subtilis belong to a conserved family of proteins required for efficient plasmid and chromosome partitioning in many bacterial species, associated to the par operon. It was analysed the replication initiation and origin positioning in Δsoj, Δspo0J and Δ(soj-spo0J) cells. All of the mutations caused increased initiation of replication and, to varying extents, affected origin positioning, related to the phenotype of ΔyabA-mutants.
The objective of this study was to show the effect of Δ(soj-spo0J) to the initiator protein DnaA. Therefore a strain was constructed that contains YFP-DnaA and Δ(soj-spo0J). The cells were investigated via fluorescence microscopy to show specific localization patterns. Another approach aims at the biochemical investigation of the interaction. Therefore, DnaA and Soj were cloned into a pET-Duet-vector for heterologous expression in E.coli rosetta cells. The His-tagged proteins were purified by FPLC and both proteins were buffered to the same reaction-buffer for SPR-studies. Surface plasmon resonance (SPR)-biosensor techniques directly provide essential information for the study and characterization of protein–DNA interactions. This technique monitors the interactions in real-time. The origin-region containing several DnaA-boxes, ranging from 359° to 0,4° (~670 bp) was labeled to the matrix over biotin and the DnaA protein was then added. DnaA was clearly able to bind to the origin-region, although there was a significant difference in the binding affinity using conditions with or without ATP. Addition of Soj had a significant effect on DnaA regarding the binding to oriC. By incubation of those two proteins before addition to the sensor-chip there was a decrease in the measured binding ability of DnaA detectable.
It could also be shown that a triple mutant Δ(soj-spo0J) + ΔyabA is lethal and after addition of a high amount of chromosomal DNA regression is taking place whereby yabA gets repaired. This experiment revealed that there seems to be only two regulatory systems in Bacillus subtilis to regulate the initiation of replication.

Double strand break repair
All cells need to ensure the stability of their genetic material for survival. Cells are constantly facing the defiance of repairing numerous alterations in their genetic material that occur under normal physiological conditions. Unrepaired DNA lesions can lead to double-strand breaks. Therefore, cells have evolved several distinct mechanisms to help them maintain the structural and informational correctness of their DNA.
Homologous recombination plays a crucial role in maintaining this genome stability. In eukaryotes and bacteria, the assembly of “multiprotein complexes” into discrete foci at sites of unrepaired double-strand breaks was observed. It was found that the SMC-like protein RecN, RecF and RecO proteins that are involved in DNA recombination play an important role in DNA double-strand break repair in Bacillus subtilis. Although the appearance of the involved repair proteins is known the repair mechanism itself and the interplay of these protein-complexes are still unclear.
The objective of this study was to find unknown interacting partners based on the tandem affinity purification (TAP) method. This method allows rapid purification of complexes under native conditions, without overexpression. In the case of the repair protein RecN the cells got induced by mitomycin C causing DNA damage. The first result of this purification after identification with mass spectrometry was an interaction with subunit gyrase A (GyrA), a type II topoisomerase, as well as RecR. Microscopically analysis revealed co-localization pattern of RecN, RecR and GyrA.
The next step was a reduction of GyrA activity via novobiocin (a specific inhibitor of gyrase) and the monitoring of the effect on the ability to repair double strand breaks. The results show that the survival rate after mitomycin C treatment strongly decreases indicating an important role of GyrA for the double strand break repair process.


SWD-Schlagwörter: Replikation , Heubacillus , DNS-Reparatur
Freie Schlagwörter (englisch): DNA break repair , replication
Institut: Institut für Biologie 2
Fakultät: Fakultät für Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Graumann, Peter (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 20.02.2012
Erstellungsjahr: 2012
Publikationsdatum: 21.03.2012
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