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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-85742
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/8574/


Sommer, Anke

Expressionsanalysen von Aminoacylasen - Untersuchungen zu Pathomechanismen angeborener Stoffwechselstörungen

Expression studies of aminoacylases - studies on pathogenetic mechanisms in inborn errors of metabolism

Dokument1.pdf (3.424 KB) (md5sum: 46ee4ac033383edd305c6327c254512f)

Kurzfassung in Deutsch

Expressionsanalysen von Aminoacylasen – Untersuchungen zu Pathomechanismen angeborener Stoffwechselstörungen
Der Aminoacylase (ACY)1-Mangel und der Morbus Canavan (ASPA-Mangel) sind autosomalrezessiv vererbte Stoffwechseldefekte, die durch Mutationen im ACY1- bzw. im ASPA-Gen ausgelöst werden. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das Wissen zu molekularen und biochemischen Zusammenhängen bei diesen seltenen stoffwechseldefekten und zur Aminoacylase (ACY) 3 zu erweitern.
Der Nachweis von Mutationen im ACY1- und im ASPA-Gen bei pädiatrischen Patienten diente als Basis zur Durchführung von Expressionsstudien. Nach zielgerichteter Mutagenese fand die Proteinexpression in einer humanen embryonalen Nierenzelllinie (HEK293-Zellen) statt, die postranslationale Modifikationen, einschließlich Glykosylierungen, sicherstellen kann. Sieben von elf ACY1-Mutanten führten zu keinem Proteinnachweis im ACY1-Western-Blot und hatten einen Aktivitätsverlust zur Folge im Vergleich zum Enzym mit der Referenzsequenz. Vier weitere ACY1-Mutanten waren hingegen im Western Blot detektierbar und resultierten in keiner Abnahme der ACY1-Aktivität. Alle fünf exprimierten ASPA-Mutanten führten zum Verlust der ASPA-Aktivität, obwohl die Bildung von mRNA nur für die ASPA-Variante ASPA Phe295Ser ausfiel. Kombinationsstudien bezüglich einer Überlappung der Substratspezifitäten von ACY1 und ASPA bestätigten, dass N-Acetyl-L-Methionin kein Substrat für die ASPA darstellt und N-Acetyl-L-Aspartat nicht von der ACY1 gespalten wird, die Enzyme also einen Ausfall nicht wechselseitig kompensieren können. Über die Aminoacylase 3 (ACY3) ist bisher nur wenig bekannt. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals begonnen, menschliches ACY3-Protein zu charakterisieren. Dafür wurde die ACY3 mit der Referenzsequenz ebenfalls in HEK293-Zellen überexprimiert und ein geeigneter Enzymaktivitätstest unter Verwendung von N-Chloroacetyl-L-Tyrosin als Substrat. Kinetische Untersuchungen lassen für dieses Substrat auf einen KM-Wert von 1,0-15,1 mM (Vmax von 14,8-100,0 μmol*(g*min)-1) schließen. Die Genexpression der humanen ACY1, ASPA und ACY3 in Niere, Gehirn, Lunge sowie Leber wurde mittels quantitativer Polymerase-Kettenreaktion überprüft. Die höchsten mRNA-Syntheseraten der ACY1 und ACY3 wurden in der Niere detektiert, gefolgt von Gehirn, Leber und Lunge. ASPA wurde am meisten in der Niere und im Gehirn exprimiert. Die Erkenntnisse der vorliegenden Dissertation tragen zu einem besseren Verständnis der molekularen Merkmale der angeborenen Stoffwechseldefekte ACY1- und ASPA-Mangel bei, verbessern die Diagnostik des Morbus Canavan und eröffnen eine Perspektive auf die Labordiagnostik des ACY3-Mangels.


Kurzfassung in Englisch

Aminoacylase 1 deficiency (ACY1 deficiency) and Canavan disease (ASPA deficiency) are inborn errors of metabolism, which follow an autosomal recessive trait of inheritance, due to mutations in the ACY1 gene or ASPA gene. This thesis aims to a better understanding of the molecular basis of these two inborn errors of metabolism and of the aminoacylase 3 (ACY3). Mutations analysed in the ACY1 or ASPA genes of paediatric patients were inserted by site directed mutagenesis to develop expression studies for aminoacylase 1 (ACY1) and aspartoacylase (ASPA) in human embryonic kidney cells (HEK293), which provide postranslational modifications including glycosylations. Seven out of eleven ACY1 mutants did show a loss of enzyme activity and no protein bands for ACY1 were detected in Western blot analysis. For four ACY1 mutants ACY1 enzyme activity and protein expression were analyzed. All five expressed ASPA mutants did show a loss in enzyme activity. mRNA expressions was detected for all ASPA mutants besides ASPA Phe295Ser. Combination studies showed that N-acetyl-L-methionine is not a substrate for ASPA and N-acetyl-L-aspartate is not hydrolyzed by ACY1. Information on human ACY3 is rather sparse. Therefore, human ACY3 was overexpressed in HEK293 cells and an enzyme activity test was developed by using N-chloroacetyl-L-tyrosine as a substrate. Kinetic studies lead to a KM of 1,0 - 15 mM (Vmax = 14,8 - 100 µmol*(g*min)-1). Gene expression of ACY1, ASPA and ACY3 in human organs was analyzed by quantitative polymerase chain reaction (qPCR). ACY1 and ACY3 mRNA expression was highest in kidney, followed by brain, liver and lung. Highest ASPA mRNA expression was detected in the kidney and brain. The scientific findings of this thesis help to understand the molecular characteristics of the inborn errors of metabolism ACY1 deficiency and Canavan disease, to improve the clinical diagnostics of Canavan disease and to open a perspective to diagnose an ACY3 deficiency.


SWD-Schlagwörter: Aminoacylase , Stoffwechselstörung , angeboren , Aminosäuren , Aspartoacylase
Freie Schlagwörter (englisch): aminoacylase , amino acids , inborn error of metabolism , aspartoacylase
Institut: Inst. für Biochemie und Molekularbiologie
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Friedrich, Thorsten (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 07.05.2012
Erstellungsjahr: 2012
Publikationsdatum: 11.06.2012
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