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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-86038
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/8603/


Furdas, Silviya Dimitrova

Histon-Acetyltransferase-Hemmstoffe: Synthese und In-vitro-Charakterisierung

Histone acetyltransferase inhibitors: synthesis and in-vitro-testing

Dokument1.pdf (5.113 KB) (md5sum: 56280a2aea4dd575d6b54d6726571ae4)

Kurzfassung in Deutsch

Die Enzymklasse der Histon-Acetyltransferasen (HATs) spielt in zellbiologischen Vorgängen und in der Ätiologie zahlreicher Erkrankungen eine fundamentale Rolle. Der Entwicklung von HAT-Inhibitoren als epigenetische Werkzeuge kommt eine wesentliche Bedeutung hinsichtlich neuer Erkenntnisse über zukünftige therapeutische Ansätze und die zugrunde liegenden Mechanismen zu.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden, ausgehend von Ergebnissen der Leitstruktursuche und -optimierung mittels computergestützter Methoden, zwei Substanzklassen als HAT-Hemmstoffe identifiziert. Anschließend wurden Strukturderivate synthetisiert und bezüglich ihrer HAT-Hemmung in vitro charakterisiert. Die abgeleiteten Struktur-Wirkungs-Beziehungen zeigten wiederum Ansatzpunkte für weitere Strukturoptimierung innerhalb der Enzymklasse auf. Hierzu wurde das in der Arbeitsgruppe für PCAF verfügbare antikörperbasierte heterogene Testsystem auf weitere Vertreter der HAT-Familie (Gcn5, CBP, p300) zwecks der Durchführung von Selektivitätsstudien übertragen. Darüber hinaus erfolgte erstmals in unserer Gruppe die Etablierung eines bakteriellen Überexpressionssystems zur heterologen PCAF-Gewinnung.
Zum einen wurden Pyridoisothiazolone mit variierenden aromatischen Substituenten am Isothiazolon-Stickstoffatom als potente HAT-Hemmstoffe identifiziert. Diese Verbindungsklasse bildet nach Spaltung der S—N-Bindung kovalente Disulfid-Addukte mit Cysteinresten in Zielproteinen. Es konnte gezeigt werden, dass Substitutionsmuster am Isothiazolon-Stickstoffatom entscheidend für das Selektivitätsprofil der Inhibitoren ist. N-Phenyl-Derivate hemmten alle getesteten HATs im niedrigen mikromolaren Bereich, wohingegen N-Benzyl-Analoga selektive CBP-Hemmstoffe sind. Die Untersuchungen zur Aufklärung des zugrunde liegenden irreversiblen Hemmmechanismus belegen, dass die PCAF-Hemmung sehr schnell und vom Cofaktor unabhängig erfolgt und mit der Bildung stabiler Enzym-Inhibitor-Addukte einhergeht, welche sich durch nachträgliche Thioleinwirkung nicht spalten lassen. Die Ergebnisse der vorgenommenen Verdünnungsexperimente stützen zudem die Hypothese einer irreversiblen Hemmung. Die Reaktivität der S—N-Bindung im Isothiazolongrundgerüst wurde durch eine zweistufige Schwefeloxidation deutlich herabgesetzt, was in Inkubationsstudien mit Modellnukleophilen simuliert werden konnte und einen Verlust der HAT-Hemmung in vitro herbeiführte. Vergleichbare Effekte wurden für die Bindungsaffinität oxidierter Derivate an das Humane Serumalbumin (HSA) gefunden. In Kooperationsprojekten wurden für Vertreter dieser Substanzklasse wachstumshemmende Eigenschaften in mehreren Krebszelllinien aufgezeigt.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden weiterhin Rhodanin-Indolinon-Carbonsäuren als eine neue Klasse von HAT-Hemmstoffen charakterisiert, welche Vertreter der GNAT- und der p300/CBP-Familie ohne deutliche Selektivitätstendenzen hemmen. Die vorgenommenen chemischen Modifikationen ließen den Indolinonsubstituenten zum einen und den Rhodanin-Carbonsäure-Linker zum anderen als die Strukturbausteine mit einem entscheidenden Einfluss auf die Hemmeigenschaften und somit als Ansatzpunkte für eine weitere Optimierung erkennen. Im Einklang mit den Vorhersagen und Bindungsinteraktionen aus dem Molecular Modelling wurde zudem gezeigt, dass das Vorhandensein einer freien Carboxylfunktion essenziell für die In-vitro-Hemmung ist.


Kurzfassung in Englisch

The enzyme class of histone acetyltransferases (HATs) regulates fundamental cell-biological processes and is involved in the aetiology of several diseases. For this reason the development of small molecule inhibitors of histone acetyltransferase activities as epigenetic tools may provide insights into novel therapeutic approaches and contribute to the elucidation of the disease-related underlying mechanisms.
Starting out from initial virtual screening und molecular modeling results, two different compound classes were identified as histone acetyltransferase inhibitors within this work. Subsequently, structural derivatives were synthesized and their HAT inhibitory properties were characterized in vitro. Structure-activity relationships were derived revealing starting points for further structural optimization in terms of selectivity. Concerning selectivity studies, a heterogeneous antibody-based assay system, developed for PCAF in our group, was transferred to other members of the HAT family (Gcn5, CBP, p300). In addition, a bacterial over expression system for heterologous PCAF production was established, which served as an accessible recombinant enzyme source for initial compound testing.
Pyridoisothiazolones with varying aromatic substituents on the isothiazolone nitrogen atom were identified as potent HAT inhibitors. The mode of inhibition is linked to the cleavage of the sulphur-nitrogen bond in the main scaffold of the molecule with subsequent formation of covalent disulfide adducts with cysteine residues in target proteins. The substitution pattern on the isothiazolone nitrogen atom was shown to be crucial for the selectivity profile within the HAT family. N-phenyl derivatives were characterized as potent unselective low micromolar HAT inhibitors, whereas N-benzyl analogs were selective for CBP. Different approaches were performed in order to elucidate the proposed irreversible mode of action. The observed PCAF inhibition was attained very rapidly, independent of the cofactor amount and was associated with the formation of enzyme-inhibitor adducts stable against subsequent thiol treatment. Moreover, the performed dilution experiments also supported the hypothesis of an irreversible inhibition. The reactivity of the sulphur-nitrogen bond in the isothiazolone scaffold was significantly reduced by a two-step sulphur oxidation, which could be simulated in incubation studies with nucleophiles and resulted in a loss of HAT inhibition in vitro. Similar effects were found for the binding affinity of oxidized derivatives to the human serum albumin (HSA). Growth inhibitory properties for members of the pyridoisothiazolone compound class were demonstrated for a number of cancer cell lines in a cooperation project.
A second class of moieties, whose main scaffold is a rhodanine-indolinone-carboxylic acid, was characterized as novel small molecule inhibitors of histone acetyltransferase activities, showing no selectivity trends within the GNAT and the p300/CBP families. The modifications introduced to the chemical structure led to the recognition of the indolinone substituent and the rhodanine carboxylic linker as structural units, providing the basis for further scaffold optimization. In line with molecular modelling predictions of the binding mode and interaction fields, the presence of a free carboxylic group was proved to be essential for in vitro inhibition.


SWD-Schlagwörter: Epigenetik , Histone , Acetyltransferasen , Inhibitor
Freie Schlagwörter (deutsch): HATs
Freie Schlagwörter (englisch): epigenetics , histones , acetyltransferases , inhibitors , HATs
Institut: Institut für Pharmazeutische Wissenschaften
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Jung, Manfred (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 03.05.2012
Erstellungsjahr: 2012
Publikationsdatum: 11.06.2012
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