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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-86321
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/8632/


Wallmen, Britta

Role of Tcf1 and Tcf4 splice variants in cell type-specific Wnt/beta-catenin target gene expression

Rolle der Tcf1 und Tcf4 Spleißvarianten für die zelltyp-spezifische Expression von Wnt/beta-Catenin-Zielgenen

Dokument1.pdf (8.231 KB) (md5sum: 5c8338f6acf2572b5df823962d21ce32)

Kurzfassung in Deutsch

Während der Embryonalentwicklung und im adulten Organismus muss die transkriptionelle Aktivierung von Genen in stadien- und gewebespezifischer Art und Weise erfolgen. Die zugrunde liegenden regulatorischen Mechanismen sind jedoch bislang nicht vollständig bekannt. Signalkaskaden wie dem Wnt/beta-Catenin Signalweg und seinen Kerneffektorproteinen, der Familie der Tcf/Lef Transkriptionsfaktoren, wird eine entscheidende Rolle bei diesen Prozessen zugeschrieben. Basierend auf Studien in embryonalen Stamm- (ES-) Zellen ist ein neues Konzept aufgekommen, in dem postuliert wird, dass Gene, die für Entwicklungsregulatoren kodieren, sowie gewebe-spezifische Gene in frühen Embryonalstadien in einem Zustand („poised“) vorliegen, in dem sie zwar transkriptionell abgeschaltet sind, aber rasch induziert werden können. Im Zuge der Differenzierung kommt es entweder zur Aktivierung der Gene in ihren entsprechenden Expressionsdomänen oder zur transkriptionellen Stilllegung. Dieses Modell hebt die regulatorische Funktion der Chromatinstruktur hervor. In Übereinstimmung damit weisen transkriptionell aktive Zielgene des Wnt/beta-Catenin-Signalwegs Eigenschaften von aktivem Chromatin und Tcf/Lef Besetzung auf während inaktive Gene durch repressives Chromatin und Abwesenheit von Tcf/Lef charakterisiert sind. Allerdings sind bisher weder die kausalen Zusammenhänge zwischen Tcf/Lef Bindung und den Eigenschaften des Chromatins an Wnt-Zielgenen noch die Beziehung zwischen dem Priming-Modell und der Aktivität der Signaltransduktionswege in der Embryonalentwicklung vollständig verstanden.
Das Ziel dieser Arbeit war es daher, sowohl Einblicke in die molekularen Mechanismen der Zelltypspezifität von Wnt-Zielgenen zu bekommen als auch die Rolle der Tcf/Lef Proteine im Hinblick auf Erhalt und Einrichtung von Chromatinkonformationen zu klären, um dadurch ihre Signifikanz für das Priming-Modell zu bestimmen. Dazu wurde ein murines Zellkulturmodellsystem verwendet, das aus E14 ES-Zellen, C17.2 neuralen Vorläufern und C2C12 Myoblasten besteht, und in dem die Wnt/beta-Catenin-Zielgene T/Bra, Cdx1, Cdx2 und Sp5 differenziell reguliert sind. Vergleichende Analysen von repressiven und aktiven Chromatinmodifikationen mittels ChIP sowie Reportergenanalysen und die Tcf/Lef Expressionsprofile legten einen Defekt im Genaktivierungssystem in C17.2 und C2C12 Zellen nahe anstatt einer Verstärkung spezifischer Repressionsmechanismen. Um die Tcf/Lef Familienmitglieder und Spleißvarianten zu bestimmen, die für die Induzierbarkeit von Wnt/beta-Catenin-Zielgenen verantwortlich sind, wurden Reportergenversuche sowie siRNA-vermittelte Tcf/Lef Reduktion und Tcf/Lef Isoform-spezifische Rescue-Experimente durchgeführt. Diese Analysen identifizierten eine besondere Rolle der Tcf1E und Tcf4E Spleißvarianten für die akute transkriptionelle Aktivierung ausgewählter Wnt/beta-Catenin-Zielgene. Tcf1E und Tcf4E heben sich von den anderen Tcf/Lef Isoformen durch das Vorhandensein der C-clamp ab. Von diesem strukturellen Motiv wird angenommen, dass es eine promotor-spezifische Aktivierung durch selektive DNA-Bindung vermittelt. Unerwarteterweise ergaben die ChIP Analysen trotz spezifischer Transaktivierungsfähigkeit ein vermischtes Bindungsmuster der Tcf/Lef Familienmitglieder und sprechen damit gegen das existierende Modell der C-clamp Aktivität. Um zu definieren welche Rolle die potenten Transaktivatoren Tcf1 und Tcf4 in Bezug auf das Priming-Modell spielen, wurden „loss-of-function“ und „gain-of-function“ Analysen durchgeführt. Einerseits wurden in E14 ES-Zellen Effekte des Tcf1/4-Doppelknockdowns auf die Eigenschaften von Chromatin mittels ChIP und FAIRE untersucht und zeigten, dass diese Faktoren für den Erhalt der permissiven Chromatinstruktur entbehrlich waren. Andererseits wurden in C17.2 und C2C12 Zellen die Folgen ektopischer Expression von Tcf1E, dem am stärksten transaktivierenden Faktor, im Hinblick auf Wnt-Induzierbarkeit und Chromatinkonformation getestet. Des Weiteren wurde die Tcf1E-Überexpression mit TSA/Aza Behandlung oder PRC2 Reduktion kombiniert, um repressive Chromatinstrukturen zu schwächen. Tcf1E war jedoch unter keiner der getesteten Bedingungen in der Lage, in repressives Chromatin einzudringen und die Wnt-Induzierbarkeit von reprimierten Genen wiederherzustellen, was auf eine Funktion von nativem Chromatin als grundsätzliche Barriere hindeutet. Insgesamt betrachtet stellten die Ergebnisse eine wichtige Rolle von Tcf1 und Tcf4 für die akute transkriptionelle Aktivierung von Wnt/beta-Catenin-Zielgenen heraus, zeigten aber auch ihre Entbehrlichkeit für den Erhalt und die Generierung permissiver Chromatinstrukturen. Zusammen genommen deutet dies auf eine Hierarchie hin, in der Priming-Faktoren für die Einrichtung offener Chromatinstrukturen benötigt werden, die von Tcf/Lef-Proteinen angesteuert werden können, um die Antwort auf ein Wnt/beta-Catenin-Signal auszulösen.


Kurzfassung in Englisch

During embryonic development and throughout adulthood, transcriptional activation of genes needs to be precisely orchestrated in a stage- and tissue-specific manner. However, the underlying regulatory mechanisms are currently not fully understood. Developmental signaling cascades, like the Wnt/beta-catenin pathway and its nuclear effectors, the Lef/Tcf family of transcription factors, are thought to play a key role in this process. On the other hand, based on studies in embryonic stem cells (ESCs), a novel concept emerged which suggests that at early developmental stages, genes coding for developmental regulators as well as tissue-specific genes can exist in a poised state where they are transcriptionally silent but primed for rapid induction. Upon differentiation, the poised state is resolved either into activation of the genes in their cognate expression domains or into transcriptional repression. This model emphasizes a regulatory role of chromatin structure. In agreement with this, transcriptionally active target genes of the Wnt/β-catenin pathway exhibit active chromatin features and Tcf/Lef occupancy, while inactive genes show repressive chromatin and absence of Tcf/Lef binding. However, interdependencies between Tcf/Lef binding and chromatin features at Wnt/beta-catenin target genes and the relationship between the priming model and the activity of developmental signaling cascades are not clear.
The aim of the present work was to gain insight into the molecular mechanisms underlying cell type-specificity of Wnt/beta-catenin target genes and to clarify the role of Tcf/Lef proteins with respect to maintenance and generation of chromatin conformations, thereby defining their significance for the priming model. For this, a murine cell culture model system was used consisting of E14 ESCs, C17.2 neural progenitors, and C2C12 myoblasts in which the Wnt/beta-catenin target genes T/Bra, Cdx1, Cdx2, and Sp5 were found to be differentially regulated. Comparative analyses of repressive and active chromatin features by ChIP as well as reporter gene assays and expression profiling of Tcf/Lef family members suggested a deficiency in the gene activation system in C17.2 and C2C12 cells rather than a re-inforcement of specific repression mechanisms. To identify Tcf/Lef family members and splice variants responsible for Wnt/beta-catenin target gene inducibility, reporter gene assays as well as siRNA-mediated Tcf/Lef knockdown and Tcf/Lef isoform-specific rescue were performed. These analyses identified a special role of Tcf1E and Tcf4E splice variants in acute transcriptional activation of a subset of Wnt/beta-catenin target genes. Tcf1E and Tcf4E stand out among Tcf/Lef isoforms due to presence of an exclusive structural motif, the C-clamp, which was previously proposed to mediate promoter-specific activation through selective DNA binding. Unexpectedly, ChIP analyses showed a promiscuous binding despite specific trans-activation capacities, thus arguing against the existing model for the C-clamp activity. In order to define which role the potent trans-activators Tcf1 and Tcf4 play with respect to the priming model, loss-of-function and gain-of-function analyses were performed. On the one hand, effects of a Tcf1/4 double knockdown on chromatin features in E14 ESCs were investigated by ChIP and FAIRE and demonstrated a dispensability of these factors for maintaining a permissive chromatin structure. On the other hand, consequences of ectopic expression of Tcf1E, the most potent trans-activating factor, in C17.2 and C2C12 cells were tested in terms of Wnt inducibility and chromatin conformation. Furthermore, gain-of-function was combined with TSA/Aza treatment or knockdown of PRC2 to weaken the repressive chromatin structure. However, under either condition, Tcf1E failed to invade silent chromatin and to re-confer Wnt inducibility on repressed genes, indicating that native chromatin functions as principle barrier. Taken together, the results highlight an important role for Tcf1 and Tcf4 in acute transcriptional activation of Wnt/beta-catenin target genes but show their dispensability for maintenance or generation of permissive chromatin structures. Overall, this suggests a hierarchy in which priming factors are required to create an open chromatin conformation which can be accessed by Tcf/Lef proteins to elicit Wnt/beta-catenin responses.


SWD-Schlagwörter: Chromatin , Embryonalentwicklung
Freie Schlagwörter (deutsch): beta-Catenin , T-Zell Faktoren , Wnt Signalweg , alternatives Spleißen
Freie Schlagwörter (englisch): beta-catenin , T-cell factors , Wnt signaling , alternative splicing
Institut: Inst. für Molekulare Medizin und Zellforschung
Fakultät: Fakultät für Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Hecht, Andreas (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 15.06.2012
Erstellungsjahr: 2012
Publikationsdatum: 06.07.2012
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