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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-86503
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/8650/


Wolf, Dennis

Deskriptive und funktionelle Charakterisierung der CD40L/Mac-1 Interaktion

Descriptive and functional characterization of the CD40L/Mac-1 interaction

Dokument1.pdf (28.614 KB) (md5sum: d811b7b373273e4d32197bddb9c78ae0)

Kurzfassung in Deutsch

Atherosklerose wird heute als chronisch inflammatorisches Krankheitsbild aufgefasst. Im Rahmen der zugrundeliegenden Prozesse spielt das immunmodulatorischen Zelloberflächemolekül CD40L eine wichtige pathogenetische Rolle. Überraschenderweise zeigen Vorarbeiten, dass CD40L seine proatherogene Wirkung im Gegensatz zu seinen immunologischen Funktionen nicht über seinen klassischen Rezeptor CD40 vermittelt. Ferner war die Entwicklung atherosklerotischer Läsionen unabhängig von CD40L auf hämatopoetischen Zellen, etwa leukozytären Entzündungszellen. Diese Daten legten daher eine Interaktion zwischen endothelialem CD40L und einem bisher unbekannten Bindungspartner nahe. Mit dem Integrin Mac-1 wurde erstmals ein solch alternativer Rezeptor für CD40L auf Leukozyten identifiziert. In der vorliegenden Arbeit konnte diese Interaktion deskriptiv wie funktionell eingehend charakterisiert werden. Zunächst gelang auf molekularer Ebene der Nachweis einer Bindung von CD40L an die Ligandenbindungsdomäne von Mac-1, die so genannte αM I-Domain. Hierzu wurden rekombinante Varianten beider Proteine bakteriell exprimiert und mittels Metall-Affinitäts- und Anionen-Austausch-Chromatographie aufgereinigt. Mittels einer „Peptid-Mapping“ Strategie konnte der 9 Aminosäuren lange Abschnitt E162–L170, der eine exponierte Schleife zwischen der α1 Helix und dem β-Faltblatt B in der Tertiärstruktur der I-Domain bildet, als Bindungsstelle von CD40L identifiziert werden. In diesen Versuchen kam ein lineares Peptid, M7, zum Einsatz, das die CD40L-Mac-1-vermittelte Bindung in verschiedenen Versuchansätzen konzentrationsabhängig und spezifisch hemmte. Um die Halbwertszeit dieses Peptides für in vivo Experimente zu erhöhen, wurde es modifiziert und zyklisiert (cM7). Funktionell inhibierte cM7 in Flusskammerversuchen die Adhäsion Mac-1 exprimierender Zellen auf CD40L, nicht jedoch die auf den alternativen Mac-1 Liganden GPIbα oder ICAM-1. In vivo bestätigte sich die Wirksamkeit von cM7 auf die CD40L-induzierte Leukozytenrekrutierung in einem Modell einer murinen Peritonitis. Des Weitern zeigte sich in der Intravitalmikroskopie des M. cremaster unter der Behandlung mit cM7 eine Reduktion adhärierender und rollender Leukozyten am Endothel. Schließlich resultierte die intraperitoneale Injektion von cM7 in einer in vivo Atherosklerosestudie in einer Reduktion atherosklerotischer Läsionen. Bei der histologischen Analyse der atherosklerotischen Plaques cM7-behandelter Tiere fiel dabei insbesondere ein deutlich reduzierter Gehalt an Makrophagen auf. Auch der Gehalt an Lipiden war verringert, während glatte Muskelzellen und stabiles Kollagen vermehrt gefunden wurden -eine Konstellation, die beim Menschen mit stabileren Plaques assoziiert ist. Insgesamt weisen diese Befunde erstmals nach, dass CD40L durch die Interaktion mit dem Leukozytenintegrin Mac-1 Atherogenese induziert und dass diese Interaktion mittels des Peptides cM7 therapeutisch gehemmt werden kann. Von den Ergebnissen dieser Arbeit lässt sich daher potenziell eine neue, selektive, anti-inflammatorische Therapiestrategie für die Behandlung der Atherosklerose am Menschen ableiten.


Kurzfassung in Englisch

Atherosclerosis is considered a chronic inflammatory disease and the immune-modulatory cell surface molecule CD40L figures prominently in atherogenesis. Surprisingly, CD40L does not mediate its pro-atherogenic function via its classical receptor CD40. Moreover, atherogenesis was independent of the presence of CD40L on hematopoietic cells, such as leukocytes, as previously reported. Taken together, these data suggest a role for endothelial CD40L and its interaction to an alternative binding partner. The leukocyte integrin Mac-1 has been proposed such an alternate receptor. Here, the interaction of CD40L to the leukocyte integrin Mac-1 has been characterized in a descriptive and functional manner. On a molecular level, CD40L bound to the recombinant Mac-1 I-domain which represents the main ligand binding domain. Therefore, the I-Domain was produced in a bacterial expression system and purified by metal-affinity and anion-exchange chromatography. Employing a peptide mapping strategy, we identified the motif E162-L170, an exposed loop between the α1 helix and the β-sheet B, on Mac-1 as binding site for CD40L. A linear peptide mimicking this sequence, M7, specifically and concentration-dependent inhibited the interaction of CD40L and Mac-1. cM7, a cyclisized version optimized for in vivo use, inhibited the adhesion of Mac-1 over-expressing cells to CD40L, but not to the alternative Mac-1 ligands GP1bα or ICAM-1. In vivo, cM7 decreased peritoneal accumulation of leukocytes and inflammatory cell recruitment to the endothelium in vivo. LDLr-/- mice treated with intraperitoneal injections of cM7 developed smaller, less inflamed atherosclerotic lesions featuring characteristics of stability. Specific inhibition of CD40L-Mac-1 binding may represent an attractive novel anti-inflammatory treatment strategy for atherosclerosis and other inflammatory conditions.


SWD-Schlagwörter: Arteriosklerose , Immunsystem , Therapie
Freie Schlagwörter (deutsch): CD40L , Mac-1 , Peptid
Freie Schlagwörter (englisch): atherosclerosis , CD40L , Mac-1 , peptide , inflammation
Institut: Medizinische Univ.-Klinik und Poliklinik
Fakultät: Medizinische Fakultät / Universitätsklinikum
DDC-Sachgruppe: Medizin und Gesundheit
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Zirlik, Andreas (PD Dr.)
Quelle: Circ Res. 2011 Nov 11;109(11):1269-79. Epub 2011 Oct 13.
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 03.12.2011
Erstellungsjahr: 2012
Publikationsdatum: 17.07.2012
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