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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-87114
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/8711/


Kieninger, Jochen

Electrochemical microsensor system for cell culture monitoring

Elektrochemisches Mikrosensor-System zum Zellkultur-Monitoring

Dokument1.pdf (6.016 KB) (md5sum: a0fc968508e1bee01a195d4602f860c0)

Kurzfassung in Englisch

Cell culture monitoring with microsensor systems is a marker-free, continuous measurement technique of chemical and physical parameters in cell culture, which impacts many different areas of biological research. With the focus being on eukaryotic cells, many fields such as standardisation of cell culture, cancer research, individualised (cancer) therapy, as well as cell therapy are demanding for cell culture monitoring in order to obtain reliable and reproducible results. The view on the pericellular microenvironment leads to new insight into cellular metabolism.

In this thesis the development of a cell culture monitoring system known as the Sensing Cell Culture Flask (SCCF) system, and its application in tumour cell culture experiments is described. The SCCF system allows the integration of transparent sensor chips in conventional tissue culture flasks enabling pericellular measurements without disturbing the routine work-flow in cell culture research. The system is capable of implementing any electrochemical sensor, which is demonstrated in this thesis by an amperometric (oxygen) and a potentiometric (pH) sensor principle. The applied fabrication technology was optimised to obtain cell culture compatible sensor chips, onto which the cells can settle, comparable to the situation with conventional tissue flask material.

The oxygen sensor array was based on direct amperometric sensors, operated with chronoamperometric protocols, in order to provide long-time stable measurement in cell culture medium for more than five days without the need of recalibration. Drift rates were less than 0.1 µM/day measured at 37 °C in cell culture medium. The sensitivity was found to be in the range of -0.4 – -0.8 µA/cm2/µM. During the development of the protocols, fundamental research on the oxygen reduction and oxide formation/reduction at platinum electrodes in electrolytes with neutral pH was done. Experiments were done with cyclic voltammetry, rotating disc electrode (RDE), and an electrochemical quartz micro-balance (EQCM). It was found that both the oxygen reduction and the platinum oxide processes are comparable in electrolytes with neutral pH to the situation in sulphuric acid solutions. The results from the EQCM measurements gave important information for the development of the chronoamperometric sensor protocols.

The sensor design and the measurement protocols were optimised based on finite element simulations. The oxygen sensor array was characterised especially with respect to cross-sensitivity. Also other electrochemical oxygen sensor principles, namely the potentiometric oxygen measurement and the Ross principle, applied to a direct amperometric oxygen sensor were investigated.
The potentiometric pH sensor was based on iridium oxide electrodes. In order to obtain reproducible electrodeposition of well-adhering layers, research on the deposition mechanism were done with the EQCM. Based on this results an optimised deposition procedure was developed. The sensor sensitivity was (-66.1 ± 2.2) mV/pH at 25 °C and the drift rate was less than 0.4 mpH/h measured at 37 °C.

Application specific instrumentation hardware and software was developed aiming for a robust, easy to use cell culture monitoring system.

Experiments with breast and brain cancer cells cultured in normoxic incubation conditions showed that pericellular oxygen concentration can reach levels which are normally associated with hypoxia. This emphasises the need of oxygen monitoring, especially in the field of hypoxia research, in order to obtain meaningful and reproducible results. The comparison of the glucose and lactate concentrations in cell culture medium indicates the need for future biosensor integration in the SCCF sensor chip. pH measurements allowed the comparison of acidification rates of tumour cells in buffered and unbuffered medium.


Kurzfassung in Deutsch

Zellkultur-Monitoring mit Mikrosensorsystemen ist die markerfreie, kontinuierliche Messung von chemischen und physikalischen Parametern in Zellkulturen, die für viele verschiedene Bereiche von Bedeutung ist. Mit dem Fokus auf eukariotische Zellen gibt es in zahlreichen Gebieten Bedarf an Zellkultur-Monitoringsystemen, um reproduzierbare und verlässliche Ergebnisse zu erhalten: Standardisierung von Zellkulturen, Krebsforschung, individualisierte (Krebs-)Therapie und Zelltherapie. Der Einblick in die perizelluläre Mikroumgebung führt zu neuen Erkenntnissen über den zellulären Metabolismus.

In dieser Arbeit wird die Entwicklung eines Zellkultur-Monitoringsystems, dem Sensing Cell Culture Flask (SCCF) System und dessen Anwendung in Tumorzellkulturexperimenten beschrieben. Das SCCF-System erlaubt die Integration eines transparenten Sensorchips in herkömmliche Zellkulturflaschen, was perizelluläre Messungen ermöglicht, ohne den gewohnten Ablauf im Bereich der Zellkulturforschung zu stören. Das System ermöglicht die Implementierung von beliebigen elektrochemischen Sensoren, was in dieser Arbeit mit einem amperometrischen (Sauerstoff) und potentiometrischen (pH) Sensorprinzip gezeigt wird. Die verwendete Herstellungstechnologie wurde im Hinblick auf zellkulturkompatible Sensorchips optimiert, auf denen Zellen, vergleichbar mit der Situation auf herkömmlichem Zellkulturflaschenmaterial, siedeln können.

Das Sauerstoffsensorarray basierte auf direktamperometrischen Sensoren, die mit chronoamperometrischen Protokollen betrieben wurden, um langzeitstabile Messungen in Zellkulturmedium über mehr als fünf Tage ohne Rekalibrierung zu ermöglichen. Die Driftraten betrugen weniger als 0,1 µM/Tag, gemessen bei 37 °C in Zellkulturmedium. Die Empfindlichkeit lag im Bereich von -0,4 – -0,8 µA/cm2/µM. Während der Entwicklung der Protokolle wurden Grundlagenuntersuchungen bezüglich Sauerstoffreduktion und Oxidbildung/-reduktion an Platinelektroden in Elektrolyten mit neutralem pH-Wert durchgeführt. Die Experimente erfolgten mittels zyklischer Voltammetrie, der rotierenden Scheibenelektrode (RDE) und elektrochemischer Quartzmikrowaage (EQCM). Es zeigte sich, dass sowohl der Sauerstoffreduktions- wie der Platinoxidbildungs/-reduktionsprozess in Elektrolyten mit neutralem pH-Wert und Schwefelsäurelösungen vergleichbar abläuft. Die EQCM-Messungen lieferten wichtige Hinweise für die Entwicklung der chronoamperometrischen Sensorprotokolle.

Das Sensordesign und die Messprotokolle wurden mittels finiter Elemente Simulationen optimiert. Das Sauerstoffsensorarray wurde insbesondere im Hinblick auf Querempfindlichkeit charakterisiert. Ebenso wurden andere elektrochemische Sauerstoffsensorprinzipen, namentlich die potentiometrische Sauerstoffmessung und die Anwendung des Ross-Prinzip bei einen direktamperometrischen Sauerstoffsensor, untersucht.

Der potentiometrische pH-Sensor basierte auf Iridumoxidelektroden. Um eine reproduzierbare Abscheidung von gut haftenden Schichten zu erhalten, wurde der Abscheidemechansimus mit EQCM-Messungen untersucht. Mit diesen Ergebnissen wurde ein optimiertes Abscheideverfahren entwickelt. Die Sensorempfindlichkeit betrug (-66,1 ± 2,2) mV/pH bei 25 °C und die Driftrate weniger als 0,4 mpH/h gemessen bei 37 °C.

Mit dem Ziel ein robustes, einfach handhabbares Zellkultur-Monitoringsystem zu erhalten, wurde anwendungsspezifische Hard- und Software entwickelt.

Experimente mit Brust- und Gehirntumorzellen, die unter normoxischen Inkubationsbedingungen kultiviert wurden, zeigten, dass die perizelluläre Sauerstoffkonzentration Werte erreichen kann, die normalerweise mit Hypoxie in Verbindung gebracht werden. Dies unterstreicht die Notwendigkeit von Sauerstoffmonitoring, insbesondere im Gebiet der Hypoxieforschung um aussagekräftige und reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten. Der Vergleich der Glukose- und Laktatkonzentrationen im Zellkulturmedium weist auf den Bedarf an zukünftiger Integration von Biosensoren auf dem SCCF-Sensorchip hin. pH-Messungen erlaubten den Vergleich von Ansäuerungsraten von Tumorzellen in gepufferten und ungepufferten Medien.


SWD-Schlagwörter: Elektrochemischer Sensor , Biomonitoring , Zellkultur , Sensor-Array , Krebsforschung , Sauerstoff , Wasserstoffionenkonzentration
Freie Schlagwörter (deutsch): Zellkulturmonitoring , Marker-freie Detektion , Sauerstoffsensor , pH-Sensor , Hypoxia
Freie Schlagwörter (englisch): Cell culture monitoring , marker-free detection , oxygen sensor , pH sensor , hypoxia
PACS Klassifikation 82.47.Rs , 87.85.Ox
Institut: Institut für Mikrosystemtechnik
Fakultät: Technische Fakultät (bisher: Fak. f. Angew. Wiss.)
DDC-Sachgruppe: Technik
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Urban, Gerald A. (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 11.07.2011
Erstellungsjahr: 2011
Publikationsdatum: 17.08.2012
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