Direkt zum Inhalt | Direkt zur Navigation

Eingang zum Volltext

Lizenz

Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-87164
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/8716/


Gil Girol, Christian

Untersuchungen zur Biosynthese des Kotanins in Aspergillus niger

Analysis of the biosynthesis of kotanin in Aspergillus niger

Dokument1.pdf (3.393 KB) (md5sum: 1816bf2be0be64be7078a91e24466484)

Kurzfassung in Deutsch

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Biosynthese des Sekundärmetaboliten Kotanin im Ascomyzeten Aspergillus niger. Der Schwerpunkt liegt dabei auf der Identifizierung des enzymatischen Systems, das die regio- und stereoselektive, oxidative Phenolkupplung des monomeren Cumarins 7-Desmethylsiderin zum dimeren P-(+)-Kotanin katalysiert. Die Untersuchungen dazu erfolgten über einen kombinierten Ansatz aus bioinformatischer Genomanalyse, molekular- und mikrobiologischen Methoden sowie chemischer Analytik.

Der erste Teil der Arbeit widmet sich der Untersuchung des biosynthetischen Ursprungs des hypothetischen Vorläufers von 7-Desmethylsiderin, 4,7-Dihydroxy-5-methylcumarin. Für A. niger wurden Kulturbedingungen entwickelt, die bei geringer Kohlenstoffzufuhr zu einer hohen Produktion von Kotanin führten. Dies ermöglichte die effiziente Aufnahme verfütterter, 13C-markierter Substrate des Shikimat- und Polyketidbiosynthesewegs. Durch HPLC/MS-chromatographische sowie NMR-spektroskopische Analysen des Metaboloms konnte gezeigt werden, dass 4,7-Dihydroxy-5-methylcumarin dem Polyketidbiosyntheseweg entspringt. Zusätzlich gelang erstmalig der Nachweis der Produktion endogenen Kotanins in der A. niger Variante CBS 513.88. Eine bioinformatische Analyse der genomischen Sequenzen der A. niger Varianten ATCC 1015 und CBS 513.88 führte zur Identifizierung hypothetischer Polyketidsynthase-Gene, die für die Biosynthese von 4,7-Dihydroxy-5-methylcumarin verantwortlich sein konnten. Die Suche nach konservierten Ketosynthase-Domänen lieferte 40 hypothetische Polyketidsynthasen, die mittels phylogenetischer Rekonstruktionen bezüglich ihrer Reduktaseaktivität sowie ihres Produktspektrums eingeordnet wurden. Darüber hinaus wurden die distalen Gene der Polyketidsynthase annotiert und auf eine mögliche Beteiligung an der Biosynthese von Kotanin überprüft. Durch eine Kombination der Ergebnisse der phylogenetischen Rekonstruktionen und Annotationen ließen sich die PKS auf vier Kandidaten eingrenzen. Es wurde eine Gendeletionsmethode etabliert, welche die gezielte Blockierung der Kandidatengene mittels homologer Rekombination in A. niger ermöglichte. Zur effizienten Generierung der verschiedenen, zur Gendeletion genutzten, DNA-Konstrukte wurde eine Fusions-PCR Methode entwickelt. Dies ermöglichte die sukzessive Deletion der hypothetischen Polyketidsynthasen. Über die HPLC-chromatographische Analyse des Metaboloms der Nullmutanten konnte die für die Biosynthese des Cumarins verantwortliche Polyketidsynthase ANI_1_2226184 identifiziert werden. Die Verifizierung des Ergebnisses erfolgte durch eine Genkomplementierung mittels eines autonom replizierenden Plasmids.

Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit der Analyse der an der Biosynthese von Kotanin beteiligten, modifizierenden Enzyme. Durch eine bioinformatische Untersuchung der Gene in der Umgebung von ANI_1_2226184 konnte ein putatives Biosynthesecluster des Sekundärmetaboliten skizziert werden. Die funktionelle Charakterisierung dieser Gene erfolgte über die etablierte Gendeletionsmethode, die Verifizierung der Befunde über entsprechende Genkomplementierungen. Durch diesen Ansatz konnte die an der Methylierung der 4-Hydroxygruppe des Polyketidsynthase-Produkts 4,7-Dihydroxy-5-methylcumarin beteiligte O-Methyltransferase ANI_1_1410184 sowie die an der regio- und stereoselektiven oxidativen Phenolkupplung von 7-Desmethylsiderin beteiligte Cytochrom P450 Monooxygenase ANI_1_2228184 identifiziert werden.

Im letzten Teil der Arbeit erfolgte eine bioinformatische Strukturvorhersage der Cytochrom P450 Monooxygenase ANI_1_2228184. Das Docking der Substrat- und Produktmoleküle erlaubte erste Einblicke in die Substratkoordinierung und ließ auf einen möglichen Einfluss des Enzyms auf die Regio- und Stereoselektivität der Biotransformation schließen.


Kurzfassung in Englisch

This work deals with the biosynthesis of kotanin, a secondary metabolite from Aspergillus niger. The main focus is on the identification of the enzymatic system which catalyses the regio- and stereoselective oxidative phenol coupling of the monomeric coumarin 7-demethylsiderin forming P-(+)-kotanin. The analytic approach is based on bioinformatic genome analysis, molecular and microbiological methods as well as chemical analysis.

The first part of the work covers the investigation of the biosynthetic origin of the hypothetical precursor of 7-demethylsiderin: 4,7-dihydroxy-5-methylcoumarin. Culture conditions allowing high production of kotanin with low carbon nutrition were developed. This enabled the efficient uptake of supplemented, 13C-labelled substrates of the shikimate as well as of the polyketide biosynthetic pathway. HPLC/MS-chromatographic and NMR-spectroscopic analysis proved a polyketidic origin of 4,7-dihydroxy-5-methylcoumarin. Furthermore, endogenous production of kotanin in the A. niger variant CBS 513.88 could be shown for the first time.
Bioinformatic analysis of the genomic sequences of the A. niger variants ATCC 1015 and CBS 513.88 led to identification of hypothetical polyketide synthase genes possibly responsible for the biosynthesis of 4,7-dihydroxy-5-methylcoumarin. A screening for conserved ketosynthase domains yielded 40 hypothetical polyketide synthases, which were classified according to their reducing activity and product range by phylogenetic reconstructions. Additionally, neighbouring genes of the polyketide synthases were annotated and analysed for a possible role in kotanin biosynthesis. The combination of these approaches narrowed down the hypothetical 4,7-dihydroxy-5-methylcoumarin polyketide synthases to four genes. Establishment of a gene deletion method enabled the knock-out of the candidate genes. Efficient generation of various DNA constructs for gene deletion was achieved by the development of a fusion PCR technique. The polyketide synthase gene ANI_1_2226184 responsible for biosynthesis of the coumarin was identified by HPLC-chromatographic analysis of the metabolome of gene deletion variants. By gene complementation using an autonomous replicating plasmid this result was verified.

The second part of the work deals with the analysis of the tailoring enzymes which take part in kotanin biosynthesis. Bioinformatic investigation of neighbouring genes of ANI_1_2226184 resulted in a proposal of the kotanin biosynthetic cluster. Functional characterisation of the genes was performed by targeted gene deletion, verification of the results by gene complementation. This approach proved the O-methyltransferase ANI_1_1410184 to be responsible for methylation of the 4-hydroxyl group of the polyketidic product 4,7-dihydroxy-5-methylcoumarin and the cytochrome P450 monooxygenase ANI_1_2228184 to play a role in the regio- and stereoselective oxidative phenol coupling of 7-demethylsiderin.

The last part of the work is the bioinformatic prediction of the structure of the cytochrome P450 monooxygenase ANI_1_2228184. Docking of substrate and product molecules allowed first insights in substrate coordination within the active site and prediction of a possible influence of the enzyme on the regio- and stereoselectivity of the biotransformation.


SWD-Schlagwörter: Biosynthese , Cytochrom P-450 , Naturstoff , Oxidative Kupplungsreaktion , Polyketid-Synthasen
Freie Schlagwörter (deutsch): Aspergillus niger , Biaryle , CC-Kupplung , axiale Chiralität , oxidative Phenolkupplung
Freie Schlagwörter (englisch): Aspergillus niger , biaryls , CC-coupling , axial chirality , oxidative phenol coupling
Institut: Institut für Pharmazeutische Wissenschaften
Fakultät: Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften
DDC-Sachgruppe: Chemie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Müller, Michael (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 08.02.2012
Erstellungsjahr: 2012
Publikationsdatum: 16.08.2012
Indexliste