Direkt zum Inhalt | Direkt zur Navigation

Eingang zum Volltext

Lizenz

Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-87774
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/8777/


Lederer, Mario

Relevanz von Calcium aus intrazellulären Speichern für die Produktion von Endocannabinoiden

Relevance of calcium from intracellular stores for the production of endocannabinoids

Dokument1.pdf (4.329 KB) (md5sum: 4562d69b296d42cc3a4c9065c572153c)

Kurzfassung in Deutsch

Axonterminale vieler menschlicher Neurone enthalten den G-Protein-gekoppelten CB1-Cannabinoidrezeptor. Die primäre Wirkung von Cannabinoid-Agonisten (z.B. delta-9-Tetrahydrocannabinol) im Gehirn ist eine Hemmung der Transmitterfreisetzung aus den Axonterminalen nach Aktivierung von CB1-Rezeptoren. Nervenzellen können endogene Cannabinoide synthetisieren; die bekanntesten Endocannabinoide sind 2-Arachidonoylglycerol und Anandamid. Die Hauptfragestellung der Doktorarbeit betraf den Mechanismus der Endocannabinoid-Produktion nach Aktivierung des G-alpha-q/11-Protein-gekoppelten metabotropen Glutamatrezeptors Typ 1 (mGluR1). Die Hypothese war, dass nach Aktivierung des mGluR1 Calcium aus dem endoplasmatischen Retikulum freigesetzt wird und dieses Calcium zum Triggern der Endocannabinoid-Produktion beiträgt.
Die Experimente wurden an Hirnschnitten, hergestellt aus dem Cerebellum der Maus, durchgeführt. Membranströme von Purkinjezellen des Cerebellumcortexes wurden mit Patch-Clamp-Techniken abgeleitet. In einigen Experimenten wurde, gleichzeitig mit den elektrophysiologischen Messungen, die intrazytoplasmatische Calciumkonzentation mittels Mikrofluorometrie bestimmt (Calciumimaging).

Elektrische Reizung in der Molekularschicht des Cerebellumcortexes führte zu glutamatergen excitatory postsynaptic currents (eEPSCs). Die eEPSCs wurden bei Superfusion des mGluR1-Agonisten DHPG gehemmt. Diese Hemmung fand in Gegenwart des CB1-Rezeptor-Antagonisten Rimonabant nicht statt: Es waren also Endocannabinoide und CB1-Rezeptoren an der Hemmung beteiligt. Man vermutet, dass DHPG in den postsynaptischen Purkinjezellen Endocannabinoid-Produktion auslöst und die Endocannabinoide nach retrograder Diffusion durch den synaptischen Spalt die Glutamatfreisetzung aus den präsynaptischen Axonterminalen hemmen. Die DHPG-induzierte Hemmung der eEPSCs war bei unseren Experimenten viel geringer, wenn die Calciumspeicher des endoplasmatischen Retikulums durch Thapsigargin oder Cyclopiazonsäure entleert wurden. Thapsigargin hatte eine ähnlich dämpfende Wirkung auf die Suppression von GABAergen eIPSCs durch DHPG.

In einer weiteren Versuchsserie wurde der postsynaptische mGluR1 durch endogenes Glutamat aktiviert. Dazu wurden die präsynaptischen Axone mit einer hochfrequenten, kurzen Impulsserie (Burst) stimuliert. Die Burst-Stimulation führte zu einer Suppression der folgenden eEPSCs. Diese Suppression fand in Gegenwart des mGluR1-Antagonisten CPCCOEt oder des CB1-Antagonisten Rimonabant nicht statt: Der mGluR1, ein Endocannabinoid und der CB1-Rezeptor waren also an der Suppression beteiligt. Nach Entleerung des Calciumspeichers im endoplasmatischen Retikulum durch Thapsigargin, war die Burst-evozierte Suppression der eEPSCs signifikant gedämpft – wieder ein Hinweis auf die Bedeutung der Calciumfreisetzung aus dem endoplasmatischen Retikulum für die Endocannabinoid-Produktion.
Bisher war bekannt, dass die Aktivierung von G-alpha-q/11-Protein-gekoppelten Rezeptoren Endocannabinoid-Produktion in postsynaptischen Neuronen auslöst und dass das Endocannabinoid (sehr wahrscheinlich 2-Arachidonoylglycerol) zur retrograden Suppression der Transmitterfreisetzung aus dem präsynaptischen Axonterminal führt. Der Anstieg der 2-Arachidonoylglycerol-Produktion wurde bisher so gedeutet: Das G-alpha-q/11-Protein aktiviert die Phospholipase C-beta, es entsteht Diacylglycerol und aus dem entstandenen Diacylglycerol produziert die Diacylglycerol-Lipase mehr 2-Arachidonoylglycerol. Unsere Experimente deuten auf einen anderen biochemisch naheliegenden Signalweg hin: Durch Phospholipase C-beta wird auch IP3 produziert, IP3 setzt Calcium aus dem endoplasmatischen Retikulum frei und die erhöhte intrazytoplasmatische Calciumkonzentration stimuliert die Endocannabinoid-Produktion. Es ist bekannt, dass mindestens zwei Enzyme der Endocannabinoid-Produktion Calcium-sensitiv sind: Phospholipase C-beta und Diacylglycerol-Lipase.


Kurzfassung in Englisch

Axon terminals of many human neurons contain the G-protein-coupled CB1 cannabinoid receptor. The primary activity of cannabinoid agonists (eg, delta-9-tetrahydrocannabinol) in the brain is an inhibition of transmitter release from the axon terminals by activation of CB1 receptors. Nerve cells can synthesize endogenous cannabinoids; the best known endocannabinoids are anandamide and 2-arachidonoylglycerol. The main question of the thesis concerned the mechanism of endocannabinoid production by activation of the G-alpha-q/11-protein-coupled metabotropic glutamate receptor type 1 (mGluR1). The hypothesis was that after the activation of mGluR1 calcium is released from the endoplasmic reticulum, and this calcium contributes to trigger the endocannabinoid production.
The experiments were performed on brain slices prepared from the mouse cerebellum. Membrane currents of cerebellar Purkinje cells were derived with patch-clamp techniques. In some experiments, simultaneously with the electrophysiological measurements, the intracytoplasmic calcium concentation was determined by calcium imaging.

Electrical stimulation in the molecular layer of the cerebellar cortex led to glutamatergic excitatory postsynaptic currents (eEPSCs). The eEPSCs were inhibited during superfusion of the mGluR1 agonist DHPG. This inhibition was abolished in the presence of the CB1 receptor antagonist rimonabant, therefore, both endocannabinoids and CB1 receptors are involved in this process. It is believed that DHPG triggers endocannabinoid production in the postsynaptic Purkinje cells and the endocannabinoids inhibit glutamate release from presynaptic axon terminals by retrograde diffusion through the synaptic cleft. In our experiments, the DHPG-induced inhibition of eEPSCs was significantly lower after calcium depletion of the endoplasmic reticulum by thapsigargin or cyclopiazonic acid. Thapsigargin had a similar attenuating effect on the inhibition of GABAergic eIPSCs by DHPG.

In another experimental series, the postsynaptic mGluR1 was activated by endogenous glutamate. Presynaptic axon terminals were stimulated with a short pulse series (high frequency stimulation; burst). The burst stimulation resulted in a inhibition of the following eEPSCs. This inhibition was abolished in the presence of the mGluR1 antagonist CPCCOEt or the CB1 antagonist rimonabant. Therefore, the mGluR1, an endocannabinoid, and the CB1 receptor are involved in this process. After depletion of the calcium store in the endoplasmic reticulum by thapsigargin, the burst-evoked inhibition of eEPSCs was significantly attenuated - another indication of the importance of calcium release from the endoplasmic reticulum in endocannabinoid production.
It was previously known that the activation of G-alpha-q/11-protein-coupled receptors trigger the production of endocannabinoids in postsynaptic neurons and that the endocannabinoid (most likely 2-arachidonoylglycerol) leads to retrograde suppression of transmitter release from the presynaptic axon terminal. The increase in 2-arachidonoylglycerol production has been interpreted as follows: the G-alpha-q/11-protein activates phospholipase C-beta, which produces diacylglycerol, resulting in the production of more 2-arachidonoylglycerol by the activity of the diacylglycerol lipase. Our experiments suggest a different biochemical pathway: phospholipase C-beta also produces IP3, IP3 leads to calcium release from the endoplasmic reticulum and the increased intracytoplasmic calcium concentration stimulates endocannabinoid production. It is known that at least two enzymes in endocannabinoid production are calcium-sensitive: phospholipase C-beta and diacylglycerol lipase.


SWD-Schlagwörter: Endocannabinoide , endoplasmatisches Retikulum , Calcium , glutamaterge Neurotransmission , retrograde Signalübertragung
Freie Schlagwörter (englisch): endocannabinoids , endoplasmic reticulcum , calcium , glutamatergic neurotransmission , retrograde signaling
Institut: Inst. für Pharmakologie und Toxikologie
Fakultät: Fakultät für Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Neuhaus, Gunther (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 10.10.2012
Erstellungsjahr: 2012
Publikationsdatum: 15.10.2012
Indexliste