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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-87796
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/8779/


Nguyen, Thi Thai An

Recombinant fluorescent myristoylated PreS-containing Hepatitis B virus capsid- like particles

Rekombinante fluoreszierende und myristoylierte PreS-tragende Hepatitis B Virus Kapsidähnliche Partikel

Dokument1.pdf (46.774 KB) (md5sum: 597cea4f7b9dade9eab2465b23b1535b)

Kurzfassung in Englisch

Hepatitis B virus (HBV), a relevant human pathogen, is a small enveloped virus with an icosahedral capsid formed by a single type of capsid (core protein). Recombinant core protein can assemble into genome-less capsid-like particles (CLP) that are structurally similar to authentic viral nucleocapsids and retain their high immunogenicity. This led to the development of recombinant HBV CLPs into a presentation platform for heterologous molecules or whole proteins, whose immunogenicity is strongly enhanced by display on the particulate CLPs. Immune enhancement when the foreign sequence is inserted into a central loop which comprises the immuno-dominant c/e1 B cell epitope and the most exposed part on the particle. Many sterical constraints were recently overcome by expressing two separate but self-complementing fragments, coreN and coreC (SplitCore (SC) system), to each of which foreign sequences can be fused. An extension is SC proteins presenting split GFP (SplitCore-split GFP; SCSG), which form fluorescent CLPs with new exposed termini at the SG. To these, further heterologous sequences can be added with potential applications beyond vaccines, e.g. for imaging.
The infection mechanism of HBV and the related animal viruses (DHBV), is still poorly understood, because of the lack of simple infection systems and the technical challenges in purifying virions from more 10,000-fold excess of subviral particles. These are empty envelopes, which share the envelope proteins (L, M, S for mammalian, and L and S for avian HBVs) with the virions. The N terminal PreS of the L proteins and their myristoylation are essential for infectivity; anti-PreS antibodies can neutralize the viruses and synthetic PreS peptides can potently block infection when they are myristoylated. However, the cellular factors involved in virus entry are not clearly defined.
The aim of this study was to explore the possibility of generating SCSG-CLPs, which present biologically relevant parts of the PreS domains in myristoylated form on their surface. An E. coli expressable fluorescent-CLP presenting myristoylated PreS may be a useful surrogate model for real viruses, but would be more easily accessible and tractable by the built-in GFP part. However, the feasibility of generating such particles has not yet been demonstrated for HBV CLPs, nor for recombinant particles derived from any other virus.
The work performed during this thesis has established several important aspects towards this goal. Different parts of the PreS domains from HBV, DHBV and heron HBV were fused to the SCSG carrier and shown to form fluorescent CLPs. Presentation of long PreS segments suffered from instability of the fusion proteins but CLPs with shortened PreS sequences (22 to 48 amino acids residues) could be purified in preparative amounts. Next, the PreS fusion proteins were co-expressed with yeast N-myristoyl-transferase (yNMT) in E. coli, or in vitro by recombinant NMT enzymes from different organisms plus myristoyl-coA. Either procedure drastically increased hydrophobicity and decreased solubility of the fusion proteins. Proof for myristoylation as the cause of these altered properties was obtained using azido-myristic acid and subsequent fluorescence labeling by using Click chemistry. This assay also allowed addressing NMT specificity and revealed that the HHBV PreS sequence is a substrate for human and chicken but not (or poorly) for yeast NMT; in contrast, HPreS and DPreS on the CLPs were myristoylated by all three enzymes. Immunization of rabbits with various of the PreS-SCSG proteins induced antibodies against all constituent parts, including PreS; longer PreS sequences elicited more PreS-specific antibodies. These antibodies were able to immunoprecipitate native L proteins from virus-positive sera, and the anti-DPreS antibodies neutralized DHBV infection in vitro and in vivo.
Insolubility of the myristoylated CLPs was partially overcome by reducing the myristoyl-density per particle via generation of mosaic CLPs containing a fraction of PreS-less SCSG subunits. Cell interaction studies performed with these mosaic CLPs by flow cytometry and fluorescence microscopy revealed a drastic increase in cell interaction by myristoylation, however no pronounced preference for a specific PreS sequence or cell type. Lastly, preliminary evidence indicated that the myristoylated PreS-CLPs can be internalized by an active endocytosis process, which probably requires dynamin.
In summary, the PreS-CLPs with their permanently surface-exposed myristoyl-residues appear not to be mimics of resting virions, in which the myristoyl-groups evidently must be hidden to prevent insolubility and/or cell-type independent interaction with cells. However, the myristoylated CLP may resemble a state of the infection process during which the virions transiently expose their myristoylated PreS parts.


Kurzfassung in Deutsch

Hepatitis B Virus (HBV), ein bedeutsames Humanpathogen, ist ein kleines umhülltes Virus mit einem ikosahedralen Nukleokapsid, das von nur einem Kapsidprotein (Coreprotein) gebildet wird. Rekombinantes Coreprotein assembliert spontan in Kapsid-ähnliche Partikel (capsid-like particles, CLPs) mit sehr ähnlicher Struktur und vergleichbar hoher Immunogenität. Dies führte zur Entwicklung von HBV CLPs als Präsentationsplattform für heterologe Moleküle oder kompletter Proteine, deren Immunogenität dadurch stark erhöht wird. Die stärkste Steigerung erfolgt bei Insertion der Fremdsequenz in eine zentrale Schleife, die das immundominante c/e1 B-Zellepitop enthält und den am meisten exponierten Teil der Kapsidstruktur darstellt. Sterische Einschränkungen bei der Insertion von Proteinen wurden kürzlich mit dem "SplitCore"-Ansatz weitgehend überwunden. Hierbei wird das Coreprotein in Form zweier separater, sich selbst komplementiender Fragmente, coreN und coreC, exprimiert; an jedes können Fremdsequenzen fusioniert werden. Eine Erweiterung sind SCSG-CLPs, die ein zweigeteiltes GFP präsentieren, dessen neue Termini weitere Fusionen ermöglichen.
Der Infektionsmechanismus von HBV zum einen aus Mangel an einfachen Infektionssystemen, zum anderen wegen der schwierigen Trennung der Viren von den in riesigem Überschuss produzierten subviralen Partikeln; diese leeren Hüllen beinhalten dieselben Hüllproteine wie intakte Viren. Die N-terminalen PräS-Domänen der L Proteine und ihre Myristoylierung sind essentiell für Infektiosität; anti-PräS-Antikörper können neutralisieren, und synthetische, myristoylierte PräS-Peptide inhibieren die Infektion. Die zellulären Interaktionspartner sind aber wenig oder nicht (HBV) identifiziert.
Ziel dieser Arbeit war die Erkundung von Möglichkeiten zur rekombinanten Herstellung in E. coli von SCSG-CLPs, die biologisch relevante Teile von PräS in myristoylierter Form präsentieren. Solche fluoreszierenden CLPs könnten ein Modell für echte Virionen darstellen, wären aber leichter zugänglich und könnten anhand des eingebauten GFP direkt verfolgt werden. Allerdings wurden vergleichbare Partikel bisher weder auf Basis des Coreproteins von HBV noch eines anderen Viruskapsidproteins beschrieben.
Die vorliegende Arbeit hat mehrere wichtige Aspekte auf dem Weg zu diesem Ziel etabliert. Verschiedene Anteile der PräS-Sequenzen von HBV, DHBV und Reiher HBV (HHBV) wurden an das SCSG Trägerprotein fusioniert und die Bildung intakter, fluoreszierender CLPs nachgewiesen. Lange PräS-Segmente erwiesen sich als instabil, aber verkürzte Varianten (22 - 48 aa) ließen sich präparativ isolieren. Zur Myristoylierung durchgeführte Koexpression mit N-Myristoyltransferase aus Hefe (yNMT) und in vitro Inkubation mit rekombinanten NMTs plus Myristoyl-CoA erhöhten drastisch die Hydrophobizität der Fusionsproteine und verringerten ihre Löslichkeit. Myristoylierung als Ursache wurde durch Einsatz von Azidomyristinsäure und Fluoreszenz-Markierung mittels "Click-Chemie" nachgewiesen. Dies erlaubte auch eine Charakterisierung der Spezifität der NMT-Enzyme. NMT aus Mensch und Huhn, aber nicht Hefe-NMT führte zur Myristoylierung von Reiher-HBV PräS; HBV und DHBV PräS wurden von allen NMTs myristoyliert. Die Immunisierung von Kaninchen mit den PräS-SCSG Proteinen induzierte Antikörper gegen alle Teile der Fusionsproteine, inklusive PräS; längere PräS Segmente führten zu mehr PräS-spezifischen Antikörpern. Diese konnten natives L Protein aus viruspositiven Seren immunpräzipitieren, und die anti-DPräS Seren neutralisierten die DHBV Infektion in vitro und in vivo. Daraus ließ sich auf eine ähnliche Struktur der PräS-Domänen in CLPs und in Virionen schließen.
Die Unlöslichkeit der myristoylierten CLPs wurde zumindest partiell durch Einbau von Untereinheiten ohne PräS in "Mosaik-CLPs" überwunden, die eine geringere Oberflächendichte an Fettsäureresten enthalten. Die Untersuchung der Zell-Interaktionen dieser Mosaik-CLPs per Durchflusszytometrie und Fluoreszenzmikroskopie zeigte einen drastischen myristoylierungsabhängigen Anstieg der Zellbindung, aber keine Präferenz für bestimmte PräS-Sequenzen oder Zelltypen. Schließlich ergaben sich mittels konfokaler Mikroskopie Hinweise, dass die myristoylierten CLPs über einen aktiven, vermutlich Dynamin-abhängigen Prozesses internalisiert werden.
Die Myristoyl-PräS-präsentierenden SCSG CLPs kein Modell für ruhende Virionen darstellen. Offensichtlich müssen in den Virionen die Myristoyl-PräS-Anteile verborgen vorliegen, um Unlöslichkeit und unspezifische Interaktionen mit Nicht-Hepatozyten zu verhindern. Sehr wohl könnten die CLPs aber einen Zustand der Viren nachahmen, den diese nur transient während des Eintrittsvorgangs einnehmen.


SWD-Schlagwörter: Hepatitis B , Hepatitis-B-Surface-Antigen , HBV-capsid-like particle
Freie Schlagwörter (englisch): PreS , HBV , CLP , capsid-like particle , GFP
Institut 1: Institut für Biologie 3
Institut 2: Medizinische Univ.-Klinik und Poliklinik
Fakultät: Fakultät für Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Nassal, Michael (Prof. Dr.)
Sprache: Englisch
Tag der mündlichen Prüfung: 15.10.2012
Erstellungsjahr: 2012
Publikationsdatum: 23.10.2012
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