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Bitte beziehen Sie sich beim Zitieren dieses Dokumentes immer auf folgende
URN: urn:nbn:de:bsz:25-opus-87840
URL: http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/8784/


Treutler, Eva

Untersuchungen zur Isolierung von eps-RNA-Polymerase-Komplexen des Hepatitis-B-Viruses durch RNA-Affinitätsreinigung

Studies about the isolation of eps-RNA-polymerase complexes of Hepatitis-B virus via RNA affinity purification

Dokument1.pdf (5.556 KB) (md5sum: 2ed394c5658a61f7d6d85b8af13bcd72)

Kurzfassung in Deutsch

Das Hepatitis B Virus (HBV) ist ein kleines umhülltes, humanpathogenes Virus und der Prototyp der Familie der Hepadnaviren. Hepadnavirionen enthalten ein partiell doppelsträngiges, relaxiert zirkuläres DNA-Genom (RC-DNA), das durch reverse Transkription eines RNA-Intermediates, der prägenomischen RNA (pgRNA), mittels der viralen Polymerase (P-Protein) entsteht. Die Initiation der reversen Transkription findet über einen ungewöhnlichen Protein-Priming-Mechanismus statt, wobei ein Tryrosin-Rest der Terminalen Protein-Domäne (TP) der Polymerase als Akzeptor für die Verknüpfung des ersten Desoxyribonukleotids dient. Hierzu muss die Polymerase an das strukturierte eps-Element am 5’-Ende der pgRNA binden, wobei eine Teilregion von eps als Matrize für das erste und zwei bis drei weitere Nukleotide dient. Über die strukturellen Grundlagen dieses Priming-Prozesses, der in vivo simultan die Verpackung von pgRNA und Polymerase in Nukleokapside auslöst, ist derzeit nur sehr wenig bekannt, da die rekombinante Herstellung aktiver Polymerase in ausreichenden Mengen nicht möglich ist.
Ziel dieser Arbeit war es, Methoden zur spezifischen Anreicherung der aktiven Polymerase- eps-RNA - Komplexe zu entwickeln. Als Grundprinzip sollte eine das eps-Element enthaltende RNA-Affinitätsmatrix dienen, an welche die aktiven Polymerase-Moleküle spezifisch binden und nach Entfernen der unerwünschten Komponenten spezifisch wieder eluiert werden können. Da keines der bekannten Systeme zur Anreicherung jeder Art von RNA-bindenden Proteinen geeignet ist und da sich die hepadnavirale Polymerase über Jahre als besonders schwer handhabbares Protein herausgestellt hat, wurde eine ganze Serie verschiedener RNA- und Protein-tags in unterschiedlichen Kombinationen getestet. Als RNA-tags, die an die eps−RNA fusioniert wurden, dienten ein Aptamer gegen Tobramycin (TBMC), die Bakteriophagen RNA-Elemente BoxB und MS2-Operator sowie der erst kürzlich beschriebene BoxB- und Ribozym-haltige ARiBo-tag. Als RNA-Bindungspartner dienten Varianten des BoxB-bindenden Peptides aus dem lambda-N-Protein und dimere Formen des Coatproteins des MS2-Phagen, für die Immobilisierung der His6-tag bzw. das Maltose-bindende Protein (MBP).
Bezüglich Bindungs- und Elutionseffizienz erwies sich ein His6-MBP-lambda-N-Protein, immobilisiert an Ni-NTA-Agarose, als am besten geeignet. Insgesamt erscheint daher die Kombination von BoxB-tag, His6-MBP-lambdaN-Protein und Ni-NTA-Agarose als das vielversprechendste System zur Immobilisierung aktiver Polymerase-eps−RNA Komplexe.
Als bisher ungelöstes Hauptproblem erwies sich aber die geringe Löslichkeit und hohe Aggregationstendenz der Polymerase, die in allen bekannten zellfreien Systemen zum größten Teil unlöslich und inaktiv vorliegt; die alternative, renaturierende Aufreinigung aus Inclusionbodies erfordert derzeit hohe Konzentrationen (> 1 M) an nicht-detergentem Sulfobetain (NDSB), welche die zahlreich notwendigen Protein-RNA-Interaktionen stören.


Kurzfassung in Englisch

Hepatitis B virus (HBV) is a small, enveloped pathogenic virus and the prototypic member of the hepadnavirus family. Hepadnavirions contain a partially double-stranded, relaxed circular (RC) DNA genome which arises by the viral polymerase (P protein) mediated reverse transcription of an RNA intermediate, the pregenomic (pg) RNA. Reverse transcription is initiated by an unusual protein-priming mechanism, by which a Tyr-residue in the Terminal Protein (TP) domain of the polymerase serves as acceptor for the 5´ terminal deoxynucleotide of the DNA. This requires the polymerase to bind to the structured eps-element near the 5´ end of the pgRNA, with a specific region within eps acting as template for the first and two or three more DNA nucleotides. The structural basis of this priming process which in vivo also triggers coencapsidation of pgRNA and polymerase into newly forming capsids is largely unknown because recombinant expression of active polymerase in sufficient quantities is currently impossible.
The aim of this work was therefore to identify suitable methods for the specific enrichment of the active polymerase - eps-RNA complexes. Principally, this should be achievable by using a eps-containing RNA affinity matrix to which the active polymerase molecules specifically bind and which can be eluted after all undesired components have been washed out. Given that none of the established systems is suitable for all kinds of RNA binding proteins and the notoriously problematic properties of the hepadnaviral polymerase, a whole range of different RNA- and protein-tags were tested in various combinations. RNA tags fused to eps-RNA included an aptamer against tobramycin, the bacteriophage RNA elements BoxB and MS2 operator, and the recently reported ARiBo tag which combines BoxB with a built-in ribozyme. For immobilization, fusion proteins were used which combined a binding partner for the RNA tag plus an additional tag for binding to different matrices, e.g. Ni-NTA agarose or amylose. Employed RNA binding partners included variants of the BoxB binding peptide from the lambdaN protein and dimeric forms of the phage MS2 coat protein, immobilization tags the His6-peptide and the maltose-binding protein (MBP).
Regarding matrix binding and elution, a His6-MBP-lambdaN protein immobilized to Ni-NTA agarose showed the best properties. Together, this suggests the combination of BoxB-tag, His6-MBP-lambdaN and Ni-NTA agarose as the most promising system to immobilize and purify active polymerase - eps-RNA complexes.
However, the poor solubility and aggregation tendency of the polymerase, which in all current cell-free systems is largely insoluble and inactive, remained as an unresolved key problem. The renaturing purification from inclusionbodies, used as an alternative, requires high concentrations (> 1 M) of non-detergent sulfobetain (NDSB) as solubilizing agent, and these interfere with the numerous protein-RNA interactions required for the system to function.


SWD-Schlagwörter: Hepatitis-B-Virus , Hepatitis B , Polymerase , RNA , RNA-Bindungsproteine
Freie Schlagwörter (deutsch): Affinitätsreinigung , RNA-tags , ARiBo
Freie Schlagwörter (englisch): Hepatitis B virus , polymerase , RNA , affinity purification
Institut: Institut für Biologie 2
Fakultät: Fakultät für Biologie
DDC-Sachgruppe: Biowissenschaften, Biologie
Dokumentart: Dissertation
Erstgutachter: Beyer, Peter (Prof. Dr.)
Sprache: Deutsch
Tag der mündlichen Prüfung: 22.10.2012
Erstellungsjahr: 2012
Publikationsdatum: 30.10.2012
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